论文部分内容阅读
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种弯曲杆状、具有极生鞭毛的革兰氏阴性菌。广泛存在于沿岸海水、沉积物和海洋动物中,能引起世界范围内的40多种海水、淡水鱼及其他养殖动物发生弧菌病。鳗弧菌也是我国海水养殖动物的重要条件致病菌,鳗弧菌大面积的感染给养殖业带来了巨大的经济损失。已发现多种鳗弧菌的毒力因子,如铁载体、外膜蛋白、溶血素、脂多糖、细胞毒素等跟致病性有关,但鳗弧菌的致病机理目前还不是完全清楚。在自然环境下,细菌要面临高温、饥饿、高渗透压、氧胁迫等不良的环境压力。细菌的应激反应过程比较复杂,涉及多种基因的调控。rpoS基因编码RpoS蛋白,又称为σS或σ38,它是RNA聚合酶的一种σ因子。当进入稳定生长期的细菌受到环境压力时,依赖于DNA的RNA聚合酶亚基σS是一个主要的调控子,能够增强细胞对外界不良环境的抗逆性和适应能力。当rpoS基因突变后,大肠杆菌对各种胁迫因子如饥饿、H2O2、高渗透压及低pH等的敏感性增强,研究表明在稳定期的大肠杆菌中,RpoS直接或间接调控接近200个蛋白。从鳗弧菌W-1基因组DNA克隆了1002 bp的特异性片段,含有完整的rpoS基因阅读框,编码333个氨基酸残基的蛋白质。与国外已发表的鳗弧菌rpoS基因的序列相似性为100%,与霍乱弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、溶藻胶弧菌的氨基酸序列相似性分别为78%,77%,77%,76%,75%,与大肠杆菌的氨基酸序列相似性为71%。将该基因克隆于表达质粒pET-24d(+)并在大肠杆菌中表达,用镍亲和层析柱纯化表达蛋白,SDS-PAGE分析表明纯化的蛋白为单一条带,蛋白分子量约42 kDa。用PCR扩增鳗弧菌rpoS基因开放阅读框中的120～537大小为468 bp的部分同源片段,扩增片段经纯化后克隆入pUCm-T质粒,再将目的基因片段酶切分离后连接到自杀质粒pNQ705,转化大肠杆菌SY327,在含氯霉素的LB平板上筛选阳性克隆,再将重组质粒转入供体菌大肠杆菌S17-1。构建接合供体菌S17-1/pR3。该菌与野生型鳗弧菌W-1发生接合,经过同源重组,自杀质粒插入鳗弧菌rpoS基因而使其失活,用含有氯霉素的TCBS培养基筛选得到鳗弧菌rpoS基因突变株。研究了鳗弧菌rpoS基因突变株的性质及对高渗透压、过氧化氢、热激、紫外辐射等环境应激的抵抗力。结果发现鳗弧菌rpoS基因突变株对氧化应激和高温的耐受性明显降低。5 mM H2O2作用1 h后,野生菌株的存活率为0.01%,而突变菌株的存活率为0.001%,与野生菌株相比降低了10倍(p<0.05)。45℃热激处理45 min后野生菌株的存活率为0.1%,而突变菌株的存活率为0.003%,与野生菌株相比降低了33倍(p<0.05)。紫外照射20s时野生菌株的存活率为0.31%,突变菌株的存活率为0.0307%,与野生菌株相比降低了10倍(p<0.05),但随着时间的延长,1min后野生菌株的存活率为0.015%,突变菌株的存活率为0.0053%,与野生菌株相比降低了3倍(p>0.05)。高渗透压下4 h后野生菌株的存活率为0.025%,而突变菌株的存活率为0.0032%,比野生菌株相比降低了7.8倍(p>0.05)。将野生和突变株分别在低温寡营养条件下培养40天,野生株的可培细胞数从5.00×107 mL-1较低到5.30×104 mL-1,突变株的可培养细胞数由5.73×106 mL-1降低到2.20×104 mL-1,二者之间差异不明显(p>0.05)。研究了鳗弧菌rpoS基因突变株胞外酶活力的变化,结果发现突变株的胞外总蛋白酶含量和过氧化氢酶活力分别是野生株的75.15% (p<0.05)和32.14% (p<0.01)。突变株卵磷脂酶、脂酶、淀粉酶、酪蛋白酶和溶血素的活力分别是野生菌的35.71% (p<0.01),40.00% (p<0.05),66.70% (p<0.05),38.03% (p<0.05)和16.00% (p<0.05)。将野生菌株和突变菌株注射斑马鱼,研究了鳗弧菌rpoS基因突变株对斑马鱼的致病性,结果发现野生菌株和突变菌株半数致死量(LD50)分别是8.66×104CFU/mL和2.55×106 CFU/mL,表明RpoS因子在鳗弧菌致病性方面发挥重要的作用。