2014年,中国已有25个省(直辖市、自治区)发展鲑鳟养殖业,全年总产量达39,164吨。然而,不断出现的疾病对中国迅速成长的鲑鳟养殖业造成极大危害,特别是传染性造血器官坏死病(Infectious haematopoietic necrosis,IHN)。IHN是一种主要感染鲑鳟的病毒性传染病,感染后死亡率达90%以上,其病原为隶属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)粒弹状病毒属(Novirhabdovirus)的传染性造血器官坏死病毒(Infectious heamotopoietic necrosis virus,IHNV)。自1985年中国黑龙江省首次报道IHN以来,该病已传播至中国北京、河北、辽宁、山东、甘肃、四川、吉林、新疆等省(直辖市、自治区)。据2014年中国水生动物卫生状况报告显示,北京、河北、辽宁、山东和甘肃5省(直辖市)冷水鱼养殖场点IHN平均阳性率为36.7%,且局部发生IHN疫情。其中,河北IHN平均阳性率更是高达84.6%。更值得注意的是,部分地区的鲑鳟原良种场和重点苗种场被检出IHN,成为中国鲑鳟养殖业发展的重大安全隐患。因此,明确IHNV在中国分布和遗传进化特征,为其风险分析和防治具有重要意义。另外,中国每年从国外引进大量鲑鳟发眼卵,而国外不断发生的IHN疫情,需要我们不断提高检疫技术水平,以防致病力强和新基因型IHNV毒株传入。本研究旨在明确IHNV在中国的分布、遗传进化、传播路径和变异情况,解析IHNV中国株全基因组特征及基因突变情况,并建立相应的检测方法,以期用于IHNV的检疫和防控。本研究从中国黑龙江、吉林、辽宁、河北、四川、云南、甘肃7省采集鲑鳟样品428份,50个样品IHNV检测结果为阳性,平均阳性率为11.68%。基于IHNV mid G序列的遗传进化分析表明,49株(49/50)IHNV属于J基因型J Nagano基因亚型,1株(1/50)属于M基因型MN基因亚型。另外,Bj LL中国株属于M基因型MA基因亚型,而非之前报道的U基因型。这是首次在中国监测到M基因型MN基因亚型IHNV。针对新基因型的传入,本研究对输华鲑鳟的检疫工作提出相应风险管理措施建议。遗传进化分析推断MN基因亚型IHNV株于1994年前由美国传入中国,并在中国辽宁地区流行,而MA基因亚型IHNV株于2003年由美国传入中国,并在北京地区流行。50株IHNV可分为11个序列类型,即m G801J~m G8010J和m G811M。其中,39株IHNV(39/50)属于m G801J序列类型,1株属于m G802J序列类型,2株属于m G803J序列类型,2株属于m G804J序列类型,m G805J~m G810J和m G811M序列类型各1株。综合分析IHNV中国株序列类型、遗传进化和流行病学信息,推测m G801J序列类型(39株IHNV)IHNV毒株可能由同一毒株进化而来,且由黑龙江通过发眼卵传播至甘肃、辽宁、吉林和河北地区。2株IHNV云南株属于m G804J序列类型,推断云南地区IHNV的传染源来自黑龙江。甘肃地区监测到m G801J和m G805J 2种序列类型,并推断传染源来源于黑龙江和河北地区。四川IHNV株属于m G810J序列类型,推测IHNV传入四川后,在当地养殖场交叉传播,且与当地环境相互作用下,可能其毒力发生变化。本研究报道IHNV感染七彩鲑(Salvelinus fontinalis)并导致其出现低水平死亡率,为IHNV易感动物研究提供参考。从发病的七彩鲑中分离到一株IHNV,将其命名为Ch20101008株,并成功克隆其全基因组。该毒株基因组大小为11,129bp,含有N、P、M、G、NV和L 6结构基因,整个基因组有198个碱基位点发生基因突变,其中53个碱基突变导致氨基酸改变,在L基因5’UTR 4959位点缺失1个碱基A。相对于U基因型IHNV毒株,中国株全长G基因共15个碱基位点出现突变,且7个导致氨基酸突变,为IHNV中国株疫苗研制和致病机理研究提供参考。为实现快速、准确、定量检测IHNV,本研究建立了微滴式数字RT-PCR方法(Reverse transcriptase digital droplet PCR,RT-dd PCR)、RT-LAMP荧光方法(Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)和特异性的单克隆抗体,并对其进行初步验证和应用。与实时荧光RT-q PCR相比,RT-dd PCR方法表现出与之相近的特异性、灵敏性和重复性,最低检测限为0.6copies/μL,且RT-dd PCR方法实现了对IHNV的绝对定量检测。实际应用过程中,RT-dd PCR方法的检出率高于RT-q PCR方法。所建立的RT-LAMP荧光检测方法具有较好的灵敏性和特异性,且较大幅度缩短了检测时间,避免了由于开盖加染料而导致的假阳性问题。RT-LAMP荧光检测方法的检测限为3.64×10-7μg/μL,比常规RT-PCR高1,000倍,和实时荧光RT-q PCR相同。将RT-LAMP荧光检测方法进行初步应该,结果表明该方法与RT-q PCR方法、RT-PCR的诊断特异性相同,但诊断灵敏性低于RT-q PCR方法。本研究以IHNV全长G基因的表达产物为抗原,通过常规技术筛选出2株抗IHNV的单克隆抗体(5H3和6G7),其效价分别为1:18,000和1:20,000,两株抗体均具有良好的特异性,并成功申请国家发明专利。应用制备的抗体,初步尝试建立了检测IHNV的荧光纳米微球检测卡,并进行了初步应用。与RT-PCR方法相比,该检测卡的阳性检出率为41.67%,说明其灵敏性低于RT-PCR方法,有待进一步优化改进。以本研究获得的成果和世界动物卫生组织(OIE)《水生动物疾病诊断手册》规定的检测技术为基础,我们修订了出入境检验检疫行业标准《传染性造血器官坏死病检疫技术规范》(标准号:SN/T1474-2014)。另外,将建立的RT-LAMP方法转化成农业部水产行业标准《染性造血器官坏死病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法》(已提交送审稿)。将本研究建立的三种分子生物学方法(RT-dd PCR方法、RT-LAMP荧光方法和荧光纳米微球检测卡)与《传染性造血器官坏死病检疫技术规范》规定的病毒分离、RT-PCR方法、RT-q PCR方法(文献报道)进行比较应用。结果表明,检出率由高到低依次为RT-dd PCR方法(44%)、RT-q PCR方法(43%)、RT-LAMP方法(42%)、病毒分离(23%)和荧光纳米微球检测卡(15%),样品新鲜度和采样形式等因素对每种方法的检出率影响明显。