对小菜蛾具有吸引作用的细菌筛选与分析

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小菜蛾Plutella xylostella属于鳞翅目菜蛾科,主要危害十字花科植物。农业生产上主要依靠化学农药进行防治,但小菜蛾对田间大部分使用的农药均表现出抗性,引发了农药残留、环境污染和食品安全性等一系列问题。利用挥发性气味调节昆虫的行为是控制害虫危害的一种绿色防控手段。前期本实验室对小菜蛾卵表细菌和十字花科蔬菜的叶表细菌进行了分离和吸引作用的筛选,发现卵表细菌的挥发物对小菜蛾3龄幼虫表现出不同程度的吸引作用。我们推测小菜蛾卵表细菌是否有可能自母体卵巢中垂直传播而来?卵巢中是否会拥有更多的能吸引小菜蛾幼虫的菌株?为了进一步挖掘具有吸引作用的菌株资源,我们从小菜蛾卵巢中分离的细菌菌株入手,开展了对小菜蛾幼虫具有吸引作用的菌株分离筛选、采用三代Nanopore测序技术测定菌株基因组、挥发物成分分析鉴定等工作,主要结果如下:1.采用传统的平皿培养方法,对小菜蛾成虫的卵巢组织进行了细菌的分离,共获得15株菌株;使用自行设计的高效选择装置进行吸引行为反应的筛选,发现有10株菌株的挥发物对小菜蛾3龄幼虫具有吸引作用。LB-LC1菌株对3龄幼虫的吸引效果最强,吸引指数为0.73(t=20.878,P<0.0001),经16S r DNA序列分析比对后归为假单胞菌属,为革兰氏阴性菌。对菌株的生态学功能进行初步的研究后发现,该菌株对成虫的行为和产卵无影响,可能只对幼虫起到吸引作用。2.LB-LC1菌株全基因组测序结果表明,基因组包含一个大小为4,863,178bp的完整环状染色体和一条1,804 bp的完整环状质粒,GC含量分别为61.66%、59.7%,共预测到4475个基因和4332个编码序列(CDS)。从NCBI GenBank数据库收集了20株假单胞菌完整的基因组,采用CVTree和PHYLIP构建全基因组系统发育树,结果显示LB-LC1菌株为黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva)。3.采用HS-SPME-GC-MS的方法对生长在LB培养基中的LB-LC1菌株顶空挥发物进行了收集和测定,共检测到6种化合物,主要为烯烃,尤其含有丰富的1-十一烯。在不同的生长介质和生长条件下,细菌产生的挥发物会有所变化。将LB-LC1菌株接种到LB、NB、TSB三种培养基后发现,LB-LC1菌株在NB、TSB培养基中,吸引活性显著下降。对这三种培养基中生长的LB-LC1菌株挥发物进行了比较,发现在NB培养基中,除烯烃、烷烃外还存在稠环芳香烃;而在TSB培养基中,只检测到2种烯烃。对LB-LC1菌株的挥发物进行行为作用测定后,发现1-壬烯,1-十一烯表现出对幼虫的行为作用,这两种挥发物为菌株吸引幼虫的活性挥发物。综上,本研究从卵巢组织中成功分离得到多株对3龄幼虫具有吸引作用的菌株,其中黄褐假单胞菌(P.fulva)对3龄幼虫的吸引效果最强,并测定和筛选了该菌株的挥发物。本研究期望能为将来筛选对鳞翅目昆虫具有吸引作用的菌株提供一种方法,为防治害虫提供新的思路。
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