禽流感（Al）是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。目前世界上预防禽流感最为广泛的疫苗是全病毒油乳剂灭活苗，但是这种疫苗严重影响了病毒的监测和流行病学调查，为了控制流行的H5N1亚型高致病性禽流感病毒和研制具有标记的疫苗，本实验做了以下几方面的研究：重组流感病毒（rgH5N2/PR8）的拯救、rgH5N2/PR8生物学特性研究、“标记”灭活疫苗对SPF鸡的免疫效力、流行野毒A/Chicken/SD/2010（H5N1）NA抗体的检测等四方面的内容。（1）重组流感病毒（rgH5N2/PR8）的拯救。本实验用流行的H5N1亚型AIV的HA基因和H9N2亚型AIV的NA基因及H1N1亚型IV（A/PR/8/34毒株）的6个内部基因通过流感8质粒反向遗传操作系统拯救了重组病毒rgH5N2/PR8株，为了降低重组病毒的毒力，对H5N1亚型AIV的HA基因进行了修饰，使其裂解模式由PLRERRRKR↓GL修饰为PLIETR↓GL。采用lipofectin2000（Invitrogen）转染试剂法转染293T细胞（人胚胎肾细胞），转染后的细胞接种9～10日龄SPF鸡胚繁毒，经血凝实验检测其活性后测序。结果表明，拯救病毒的基因组完全来源于重组质粒。（2）rgH5N2/PR8生物学特性。将获得的rgH5N2/PR8株在9～10日龄SPF鸡胚上连续传10代。该重组病毒的血凝效价稳定在1:2048，其半数感染量(EID₅₀)可达10^-8.77/0.1ml。该病毒的毒力显著降低，对鸡胚的ELD₅₀为10^-5/0.1ml。（3）“标记”灭活疫苗对SPF鸡的免疫效力。将rgH5N2/PR8用甲醛灭活，并与油佐剂乳化，制成灭活疫苗。给6周龄SFP鸡接种不同剂量，接种21天后，用10⁶EID₅₀剂量的H5N1野毒A/Chicken/SD/2010（H5N1）进行鼻腔攻击，结果为，接种剂量0.1ml/只的试验组可获得50%的保护，接种0.3ml/只的试验组可获得100%保护。结果表明，该疫苗具有很好的免疫效力。（4）流行野毒A/Chicken/SD/2010（H5N1）NA抗体的检测。为了确定接种了“标记”灭活疫苗的SPF鸡是否感染流行野毒A/Chicken/SD/2010（H5N1），通过间接免疫荧光试验检测其NA抗体。方法大致如下：将处于对数增长期的Sf9细胞按1×10⁶个细胞/孔接种于6孔板中，放入27℃培养箱中培养至50%～60%丰度，将滴度确定的重组杆状病毒以15μl/孔接种细胞，培养至120h后取出进行间接免疫荧光试验。统计结果显示，免疫组（共30只鸡）的鸡群在接受野毒A/Chicken/SD/02/08（H5N1）攻击后有25只鸡NA-IFA检测为阳性，细胞表面出现了黄绿色荧光，说明感染了野毒，体内除产生了N2抗体外还产生了N1抗体；另外有5只鸡经NA-IFA检测为阴性，细胞表面未出现黄绿色荧光，说明疫苗产生的抗体滴度高，阻止了强毒在体内的复制，其体内只产生了N2抗体。以上结果表明疫苗免疫不能完全阻止病毒的感染，但能防止出现临床症状。说明该方法能够区分rgH5N2/PR8标记疫苗产生的抗体和自然感染H5N1亚型禽流感病毒产生的抗体，从而能够鉴别出接种了疫苗的鸡是否感染了H5N1亚型禽流感病毒，为在免疫禽群净化H5N1亚型禽流感病毒提供一种可行的技术手段。综上，本实验获得的重组病毒株rgH5N2/PR8具有疫苗标记、繁殖滴度高、毒力低、免疫原性好等特点，可作为“标记疫苗”候选株。