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A型流感病毒属于正粘病毒科,基因组为分节段单股负链RNA,共有8个单独的RNA片段,编码至少11种病毒蛋白,即聚合酶蛋白(PBl,PB2,PA,PB1-F2),核蛋白(NP),血凝素(HA),神经氨酸酶(NA),基质蛋白(M1,M2)和非结构蛋白(NS1,NS2)。HA是流感病毒的囊膜糖蛋白,也是病毒的主要保护性抗原,可诱导机体产生中和性抗体。NP是核糖核蛋白复合体(RNP)的主要成分,与病毒基因组一起形成核糖核蛋白复合体。NP是一个高度保守的蛋白,可诱导机体产生针对不同亚型流感病毒的交叉免疫保护反应。人感染H5N1亚型禽流感病毒的病例于1997年在香港首次报道,随后从2003年至2005年,大量出现于多个东南亚国家。近年来,H5N1亚型流感病毒进一步扩散至全球各大洲,并导致数百例人感染病例。H5N1亚型禽流感病毒具有致病性强、病死率高等特点。据世界卫生组织(WHO)数据统计,从2003年12月至2010年3月,全球已有442名确诊人感染H5N1型禽流感病毒病例,其中死亡262例,死亡率近60%,对人类公共卫生安全构成巨大威胁。疫苗接种是预防流感病毒传播的最有效方法,在当前严峻的疫情形势下,研制安全、高效、具有交叉保护的新型疫苗显得尤为重要。DNA疫苗是抗烈性病毒病新型疫苗的发展方向之一。本论文围绕研制新型抗H5N1亚型禽流感病毒DNA疫苗及其分子佐剂开展工作,取得了如下成果：1.以H5N1禽流感病毒湖北分离株A/chicken/Hubei/489/2004(A/Hubei/489)为材料,RT-PCR扩增得到NP基因片段(第91到1476位氨基酸),克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-△NP。在E.coli BL21codon plus(DE3)-RIL中诱导表达截断的NP蛋白。SDS-PAGE分离纯化NP蛋白,免疫新西兰大白兔,制备了抗NP多克隆抗体,效价约为105。免疫荧光染色和Western blot分析证实,该抗体能与体外原核和真核表达的NP蛋白产生特异性结合反应。2.将A/Hubei/489 H5N1流感病毒NP基因与组织型纤维酶原激活物信号肽序列(tPAs)融合,克隆至真核表达载体pVAX1,构建了重组质粒ptPAs/NP。另将野生型NP基因克隆到pVAX1构建重组质粒pflNP作为对照。转染ptPAs/NP和pflNP至293T细胞中,共聚焦显微观察和Western blot分析结果显示,融合tPA信号肽序列的NP蛋白定位于细胞质中,并有部分NP蛋白分泌至细胞外。相反,野生型NP蛋白则完全定位在细胞核区,且不具有分泌的特性。用ptPAs/NP和pflNP做为DNA疫苗进行小鼠免疫接种,采用ELISA检测特异性抗体和ELISPOT及流式细胞分析检测特异性细胞免疫水平。结果显示,与pflNP相比,ptPAs/NP在小鼠体内诱导产生的抗体水平和细胞免疫反应水平有显著提高(p<0.01)。攻毒试验证实,ptPAs/NP免疫接种能显著增强小鼠针对同源及异源H5N1亚型流感病毒感染的免疫保护效力。3.为了探讨细胞信号分子VISA用作DNA疫苗佐剂的可能性,将细胞信号分子TRIF和VISA基因分别克隆到pVAX1,构建了真核表达质粒pVAX1-TRIF和pVAX1-VISA.利用荧光素酶报告系统对TRIF和VISA蛋白在真核细胞中的活性进行分析。结果表明,pVAX1-TRIF和pVAX1-VISA两种质粒都能在真核细胞中激发IFN-β和NF-κB启动子活性。将pVAX1-TRIF和pVAX1-VISA作为分子佐剂分别和H5N1 HA／NP表位嵌合DNA疫苗质粒(pHA/NP147-155,本实验室所构建)一起免疫BALB/c小鼠,体液和细胞免疫检测分析显示,共免疫pVAX1-TRIF和pVAX1-VISA能显著增强pHA／NP147-155诱导的细胞免疫应答水平(p<0.01),但对该DNA疫苗诱导抗体应答不产生影响(p>0.05)。攻毒试验结果显示,pVAX1-TRIF和pVAX1-VISA能增强DNA疫苗在小鼠体内诱导的抗H5N1同源和异源毒株感染的免疫保护效力。H5N1同源弱毒株攻毒后,与仅用DNA疫苗免疫组相比,DNA疫苗加佐剂组小鼠肺组织中病毒含量降低50倍以上；而VISA佐剂组比TRIF佐剂组降低近5倍(p<0.01)；高剂量H5N1异源强毒株攻毒后,VISA佐剂组小鼠100%存活,TRIF佐剂组能提供80%的保护效率,而仅用DNA疫苗免疫组小鼠存活率为40%。上述结果表明,在对DNA疫苗免疫效力增强作用方面,VISA分子明显优于TRIF,表明VISA是一种具有潜在应用价值的DNA疫苗分子佐剂。