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证候的研究是中医学基础性研究的核心部分,探讨证候的发生发展规律,揭示证候的本质,并用现代科学的语言来表述证候,是目前进行证候研究的任务。肝郁证是中医常见的证候,研究肝郁证的证候动物模型具有理论和应用双重意义。本课题在以往初步建立的慢性应激肝郁证大鼠模型的基础上,通过观察多种疏肝类方剂与非疏肝类方剂对模型的效应,并结合大鼠行为学、海马神经生化物质的变化,来进一步探讨该模型的中医证候性质及其发生发展的机制。主要研究内容与结果有:第一部分慢性应激大鼠模型中医证候性质研究1、四逆散、逍遥散、四君子汤、归脾汤与温胆汤对慢性应激模型大鼠行为学影响的比较研究采用慢性不可预知温和刺激与孤养相结合的造模方法制作模型,给予疏肝方四逆散、疏肝健脾方逍遥散、健脾方四君子汤、养血健脾方归脾汤、理气化痰方温胆汤,结果发现:动物处理21日后,模型组大鼠1%蔗糖水摄取率明显低于正常对照组,而强迫游泳不动时间明显长于正常对照组,说明动物在该慢性应激的状态下,对美味食物的兴趣降低、逃避恶劣环境的欲望减少,出现了类似人类肝郁证核心症状的郁郁寡欢的状态;逍遥散组和四逆散组大鼠1%蔗糖水摄取率明显高于模型组,强迫游泳不动时间明显低于模型组;而四君子汤、归脾汤和温胆汤组大鼠1%蔗糖水摄取率和强迫游泳不动时间均与模型组比没有明显差异;同时,模型组大鼠血清皮质酮浓度显著高于正常组,说明本研究的应激方案明显升高HPA轴活性,有明确的应激效应,四逆散和逍遥散可以明显抑制应激刺激引发的血清皮质酮浓度升高,四君子汤、归脾汤和温胆汤则无此效应。提示该模型的中医证候性质为肝郁证。2、四逆散、逍遥散、四君子汤、归脾汤与温胆汤对慢性应激模型大鼠行为学时序变化影响的比较研究在建立慢性应激肝郁证大鼠模型的基础上,分别在7日、14日、21日三个时点观察各方剂对模型的干预作用,结果显示:处理7日HPA轴亢进现象存在漂移,但在应激早期确可出现HPA轴亢进的现象,此时无明显的行为学改变;处理14日,模型大鼠血清皮质酮明显升高,强迫游泳不动时间有延长的倾向,未出现1%蔗糖水摄取率减少,四逆散显示出对应激引起的HPA轴功能亢进和强迫游泳不动时间延长的对抗作用,而逍遥散、四君子汤、归脾汤组和温胆汤则未见明显作用;处理21日,模型组大鼠血清皮质酮含量明显高于对照组,1%蔗糖水摄取率明显低于对照组,强迫游泳时间明显延长,此时四逆散和逍遥散均显示明确的对抗效应,而四君子汤、归脾汤和温胆汤则依然无此作用;在对抗应激引起HPA轴亢进和行为学变化的效应方面,四逆散发挥效应的时间要早于逍遥散,且效应持续。第二部分慢性应激大鼠肝郁证模型形成机理研究1、四逆散、逍遥散、四君子汤、归脾汤与温胆汤对慢性应激肝郁证大鼠模型海马5-HT1A受体、CREB、BDNF基因与蛋白表达的影响RT-PCR技术和Western-blot技术检测发现:模型大鼠海马5-HT1A受体、CREB、BDNF基因及CREB、BDNF蛋白表达均明显降低,四逆散和逍遥散能保护海马5-HT1A受体CREB基因、蛋白及BDNF基因,控制其降低的程度或使其恢复正常,能使BDNF蛋白得到恢复;对于CREB基因表达,四君子汤能使其恢复并超过正常水平,归脾汤和温胆汤总体上有升高的趋势,但未达到正常状态;温胆汤也能对CREB蛋白表达总体上有升高趋势,但未显示统计学意义;由于四君子汤、归脾汤和温胆汤对大鼠行为学无明显的改善作用,故其效应的意义尚难确定。2、四逆散、逍遥散、四君子汤、归脾汤与温胆汤对慢性应激肝郁证大鼠模型海马5-HT1A受体、CREB、BDNF基因和蛋白表达时序变化的影响在处理7日、14日、21日,利用RT-PCR技术和Western-blot技术检测大鼠海马相关基因蛋白的表达。结果发现:处理7日,各组大鼠5-HT1A受体mRNA表达、CREB mRNA表达和蛋白表达均无明显差异,模型组大鼠BDNF基因mRNA表达明显低于对照组,四逆散和逍遥散则均有阻止BDNF基因和蛋白表达降低的作用;处理14日,模型组大鼠5-HT1A受体mRNA表达降低变化不能确定,CREB和BDNF mRNA和蛋白表达降低,四逆散和逍遥散均有一定的保护和改善作用;处理21日,模型大鼠海马5-HT1A受体、CREB、BDNF基因及CREB、BDNF蛋白表达均明显降低,四逆散和逍遥散能保护海马5-HT1A受体CREB基因、蛋白及BDNF基因,控制其降低的程度或使其恢复正常,能使BDNF蛋白得到恢复;对于CREB基因表达,四君子汤能使恢复并超过正常水平,归脾汤和温胆汤总体上有升高的趋势,但不能达到正常状态;温胆汤也显示使CREB蛋白表达升高趋势,但未显示统计学意义;由于四君子汤、归脾汤和温胆汤对大鼠行为学无明显的改善作用,故其意义尚难确定。结论:本研究通过行为学评价和多种不同作用复方的作用效果比较,认为慢性应激大鼠模型的中医证候性质为肝郁证,可将该模型称为“慢性应激肝郁证大鼠模型”,其行为学变化的出现具有时序性,其变化的内在机制以及中药疏肝方剂的效应,可能与海马内5-HT1A受体、CREB、BDNF mRNA表达以及CREB、BDNF蛋白表达的时序变化密切相关。