大麦条纹病菌基因Pgr07060的功能研究

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大麦条纹病(Barley leaf stripe)是对大麦危害最严重的病害之一,发病严重年份造成产量损失可达70%以上,该病害由麦类核腔菌(Pyrenophora graminea)引起。研究大麦条纹病病原菌的致病机制,能够为大麦条纹病防治及抗条纹病新品种选育提供理论依据。本研究以大麦条纹病强致病野生菌株QWC中的基因Pgr07060为对象,对其功能进行了初步研究。研究结果包括以下3个方面:1.本研究克隆到了大麦条纹病菌强致病菌株QWC中的基因Pgr07060,生物信息学分析表明:Pgr07060基因的开放阅读框全长为1119 bp,总共编码372个氨基酸,其中苏氨酸占比最高,为11.80%;分析其蛋白二级结构得出,以无规则卷曲占比为主,比例达到了56.18%;Pgr07060基因编码蛋白的不稳定性指数为51.96,说明该蛋白质为不稳定的蛋白,且为亲水性蛋白;该基因编码的蛋白存在跨膜区,属于跨膜蛋白。2.构建基因Pgr07060的瞬时表达载体PVX:Pgr07060和亚细胞定位载体PCAMBIA1300-35S-GFP:Pgr07060,并转入到农杆菌GV3101中,通过注射法侵染烟草叶片,进行瞬时表达,对照组为PVX:BAX、PVX:INF1和PGR107,结果显示:PGR107不能在烟草叶片上引起细胞坏死,而PVX:BAX、PVX:INF1及基因Pgr07060均使烟草叶片发生严重皱缩,出现坏死的现象,表明基因Pgr07060可使细胞发生坏死,从而诱导免疫反应;运用在线软件Cell-PLoc 2.0预测出基因Pgr07060携带核定位序列(NLS)PPSASTKTKKKKKKSTP,为细胞核内表达基因,亚细胞定位结果显示,基因Pgr07060的绿色荧光与细胞核自发荧光重合度很高,同时膜上荧光也很强,说明基因Pgr07060既能在细胞核内表达,也能在细胞膜上表达。3.成功构建基因Pgr07060的干扰载体p Silent-1:Pgr07060与过表达载体p BARGPE1:Pgr07060。采用PEG4000介导法进行遗传转化,经潮霉素抗性筛选和荧光定量分析,获得3株干扰转化菌株和2株过表达转化菌株。转化菌株及野生株QWC中Pgr07060基因表达量检测结果表明,与野生株QWC相比较,3株干扰转化菌株的基因表达量分别下降了45.17%、65.38%和68.09%,而2株过表达菌株的基因表达量分别升高了668.88%和908.79%;通过观察培养7 d的菌落生长状况发现,与野生株QWC相比,3株干扰转化菌株的菌落生长速度分别降低了26.91%、48.19%及52.21%,而2个过表达转化株的生长速度分别增加了61.02%和95.76%(P<0.05)。观察菌株的菌丝形态发现,野生株QWC的菌丝呈细长平滑态,菌丝生长正常,而干扰和过表达转化株的菌丝均出现了明显的分隔,且菌丝间的夹角均小于野生株QWC;致病性分析显示,野生株QWC与3个干扰菌株侵染大麦高抗品种甘啤2号后均未发病,而侵染高感品种Alexis后,3个干扰菌株的发病率较野生株QWC分别降低了52.22%、49.29%和49.04%(P<0.05),并且经野生株QWC侵染的大麦长势较弱,叶片明显萎缩,叶片上有大面积病斑,发病较为严重,而干扰菌株侵染的大麦叶片发病较轻,呈黄绿色,出现较少病斑。
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