论文部分内容阅读
研究背景:急性缺血性脑卒中是全球致死率、致残率最高的疾病之一,给家庭和社会造成巨大负担。然而,除了早期静脉溶栓外,目前临床上尚缺乏缺血性脑卒中的有效治疗方法。缺血性脑卒中后的免疫炎症反应贯穿了疾病发生发展的整个病理过程,是影响缺血性脑卒中预后的重要因素。脑内固有小胶质细胞构成了脑内的第一道免疫防线,急性脑缺血发生后,小胶质细胞可被迅速激活并极化为两种不同的表型,即促炎的M1型(经典活化型)和抑炎的M2型(替代活化型),发挥组织损伤和神经保护双重作用。因此,调控小胶质细胞的不同表型及功能是减轻缺血性脑损伤、改善卒中预后的重要靶点,也是近年来卒中领域的研究热点。神经元可以通过接触依赖和非接触依赖途径调控小胶质细胞的活化和功能而维持中枢神经系统稳态,但具体的效应分子和机制有待进一步研究。既往研究发现,FasL能够直接诱导卒中后炎症反应,活化小胶质细胞而加重缺血性脑损伤。在本论文中,我们进一步明确了FasL是否能够调控活化后小胶质细胞的表型和功能,并探讨了可溶性FasL (soluble FasL, sFasL)是否参与介导了缺血性脑损伤后神经元与小胶质细胞间的相互作用,及JAK2/STAT3和NF-κB信号转导通路参与其中的作用机制。此外,我们进一步探讨了sFasL是否影响了不同表型小胶质细胞对缺血损伤后神经元的凋亡。研究方法:体内实验部分,分别对C57BL/6J小鼠及B6 Smn.C3H-FasLgld (Gld)小鼠进行急性大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,在再灌注后24小时、72小时,采用实时定量PCR和免疫荧光染色的方法检测小胶质细胞向M1/M2表型极化的程度,同时对小鼠进行了神经行为功能评分。体外实验部分,分别培养两种基因型(WT/Gld)小鼠来源的原代神经元和小胶质细胞,建立了神经元和小胶质细胞共培养体系,并制备氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation, OGD)模型,随后收集OGD后上清,一方面利用ELISA检测sFasL的表达,另一方面制备神经元条件性培基处理小胶质细胞,检测小胶质细胞向M1/M2表型极化的程度;同时,利用外源性sFasL直接刺激小胶质细胞,探索sFasL对小胶质细胞表型的调控作用;利用WB检测了JAK2/STAT3和NF-κB通路上相关蛋白的的表达情况;在部分实验中,使用sFasL中和抗体抑制其功能,AG490和JSH-23分别抑制JAK2/STAT3和NF-κB信号通路的活化。最后,分别培养两种基因型小鼠来源的原代小胶质细胞,使用LPS加IFN-y和IL-4分别诱导M1/M2型小胶质细胞极化,并收集小胶质细胞条件性培基处理OGD后神经元;利用MTT检测神经元活力,LDH分泌试验检测细胞毒性以及钙黄绿素-AM和PI染色评估神经元存活和凋亡。结果:(1)体内实验提示,在MCAO 24h和72h后,与野生型小鼠(WT)相比,FasL突变(Gld)小鼠脑梗死周边区神经元凋亡减少,神经功能缺损有所改善。(2)在MCAO 24h和72h后,Gld小鼠脑梗死周边区小胶质细胞M2型极化增多而M1型极化减少。(3)体外实验提示,神经元OGD 6h后条件性培基会诱导小胶质细胞向M1型极化,并分泌更多的炎症介质。(4)神经元OGD 6h后上清中sFasL表达水平增加;而使用sFasL中和抗体或Gld来源的神经元OGD后条件性培基处理,会显著减少M1型小胶质细胞的极化程度。(5)外源性sFasL刺激小胶质细胞M1型极化增多,炎症反应增强,同时p-JAK2 p-STAT3蛋白表达水平上调,p50/p65核转移增加,p-IκBα增多;而抑制JAK2/STAT3或NF-κB信号通路会阻断sFasL介导小胶质细胞的炎症效应。(6)M1型小胶质细胞条件性培基促进OGD后神经元凋亡,加重细胞毒性:相反,M2型小胶质细胞条件性培基减少OGD后神经元凋亡,减轻细胞毒性而发挥保护功能。(7) FasL突变后sFasL的丢失会显著减轻M1型小胶质细胞条件性培基诱导的OGD后神经元损伤。结论:(1) FasL突变减少卒中后脑梗死周边区神经元凋亡及M1型小胶质细胞极化,并能有效改善小鼠运动感觉功能。(2)缺血损伤后神经元分泌的sFasL对诱导M1型小胶质细胞的极化及炎症效应发挥着重要的作用;JAK2/STAT3/NF-κB信号转导通路的相继活化参与介导了sFasL诱导的小胶质细胞炎症反应。(3)抑制sFasL可以减轻M1型小胶质细胞诱导的缺血后神经元损伤。