彩色棉是一种能在纤维发育过程中合成和积累色素且成熟纤维具有天然色彩的棉花材料,是天然彩色纤维的主要来源。彩色棉由于具有天然色彩,在纺织加工过程中不需要漂白和印染处理,极大的减少了纺织加工的能耗水耗,同时也避免了纺织品中有机染料和无机离子残留对人体的伤害。近年来,随着人们的环保意识和绿色消费观念的增强,天然彩色棉及其纺织品越来越受到消费者们的青睐。但天然彩棉存在的产量低、品质差、色泽单一等问题,严重影响了我国彩棉产业的大力发展。棕色棉是目前应用最广泛的一类彩色棉。研究表明,深棕色纤维的颜色受Lc1控制,棕色棉纤维中的棕色色素是类黄酮家族的原花色素(PA,Proanthocyanidins)。但未见成功克隆出Lc1的报道,且棕色纤维中PA合成的调控机制也尚不清楚。揭示棉花纤维色素合成及纤维呈色的调控机理,可以为彩色棉的纤维产量和品质的改良提供理论依据,对推动我国彩棉产业发展有重大意义。在高等植物中,PA的合成主要由MYB、bHLH和WD40三类转录因子形成的三元复合体共同调控。在拟南芥棕色种皮中,参与调控PA合成的这三类转录因子分别是TT2、TT8和TTG1。其中,TT2在拟南芥种皮的PA合成中起决定性作用,它能单独激活下游PA结构基因的表达。TT8是拟南芥bHLH第三(Шf)亚家族的转录因子,与TT2共同作用时,可显著增强对下游靶标基因的激活效应。为研究棉花PA合成和纤维呈色的调控机理,本论文全面鉴定了棉花TT2和TT8同源基因,通过表达分析、棉花转基因、烟草瞬时表达,以及棕色纤维基因(Lc1)的精细定位,揭示了棉花TT2和TT8同源基因与棕色纤维PA合成和纤维棕色呈色的关系。主要结果如下:1.棉花TT2同源基因的克隆、表达分析及功能验证以拟南芥TT2氨基酸序列为探针,在雷蒙德氏棉的基因组中共找到21个相似蛋白。进化分析表明,其中5个蛋白(Gorai.001G015200、Gorai.010G087200、Gorai.001G020600、Gorai.001G020400和Gorai.001G020500)与拟南芥TT2聚为一簇,可能是棉花的TT2同源蛋白,将5个棉花TT2同源蛋白分别命名为GrTT2-1~5。从陆地棉T586的A、D亚基因组中克隆出5对棉花TT2同源基因(GhTT2s,分别是GhTT2-1A/D、GhTT2-2A/D、GhTT2-3A/D、GhTT2-4A/D、GhTT2-5A/D)。序列分析表明来源于不同亚基因组的同对基因(直系同源)序列高度相似,旁系同源基因间的序列差异较大。为验证这5对GhTT2同源基因的功能,将D亚基因组中的4个GhTT2s(GhTT2-1d~5d,除ghtt2-3d)及ghtt2-3a构建在组成型启动子(35s)的下游,并对白色棉进行遗传转化。结果表明,这些转基因棉花的愈伤组织均能被pa的特异染色剂dmaca染成蓝色,其愈伤组织中pa的含量约是野生型的5-10倍。以上结果表明,克隆的5对棉花ghtt2s基因都有促进pa合成的功能。通过qrt-pcr方法检测这10个ghtt2s在白色和棕色陆地棉的各组织及不同发育时期纤维中的表达水平。结果表明,有2对ghtt2s(ghtt2-1a/d和ghtt2-2a/d)在两种棉花各组织中的表达模式相似,主要在胚珠中优势表达。有2对ghtt2s(ghtt2-3a/d和ghtt2-4a/d)主要在两种棉花材料的特定组织中表达。ghtt2-3a只在棕色棉的纤维中高水平表达,而ghtt2-3d主要在白色棉的胚珠中表达;ghtt2-4a主要在棕色棉的花瓣中表达,ghtt2-4d主要在白色棉的叶片中表达。而ghtt2-5a/d在两种棉花的各组织中均检测不到表达信号。在纤维发育的过程中,除ghtt2-3a外,其它9个ghtt2同源基因几乎都无表达信号。ghtt2-3a在棕色棉纤维发育的不同时期均有高水平表达,同时纤维中有大量的pa合成和积累。这些结果表明,棕色陆地棉中的10个ghtt2同源基因在其各组织中的表达模式不同。进一步检测这10个基因在ril群体的棕色纤维和白色纤维中的表达,结果表明ghtt2-3a无论是在棕色纤维总cdna池及各个单株中均有高水平的表达,而在白色纤维中则不表达,其它9个ghtt2同源基因在这两种棉花纤维中也都未检测到表达信号。这些结果表明,ghtt2-3a的表达与棕色纤维共分离,可能参与纤维中棕色色素合成的调控。2.ghtt2-3a是棕色纤维lc1的候选基因前期研究表明,深棕色纤维基因(lc1)能上调整个pa的合成途径,并促进棕色纤维呈色。为明确ghtt2-3a和lc1及纤维棕色呈色的关系,我们利用两个分离群体对lc1进行了精细定位分析。从t586的bac文库中筛选出一个ghtt2-3a-bac序列,并在此基础上寻找lc1连锁的分子标记。根据tt2-3a-bac和相应d基因组序列,设计ssr引物,筛选出lc-ft3和lc08两个差异显著标记。进一步比较亲本t586和渝棉1号的差异序列并设计标记引物,最终筛选出phda、msf10-3y、tt2-3a3y、tt2-4a、ere和pec53l这6个差异显著的标记。同时以棕色棉t586和白色棉渝棉1号为亲本建立含有270个系的ril群体和1698株的f2代放大群体。用8个标记引物在两个遗传群中对ghtt2-3a和lc1进行精细定位。结果表明,在ril群体中lc1位于标记msf10a-3y和pec53l间,遗传距离为0.3cm。在f2代群体中,lc1位于遗传标记tt2-3a3y和tt2-4a间,两标记的遗传距离为0.7cm,实际距离约47kb,含有ghtt2-3a和ghtt2-5a2个基因。综合上述的表达分析和转基因功能验证结果,推测ghtt2-3a是棕色纤维lc1的候选基因,可能参与棕色纤维的色素合成和棕色呈色。3.纤维次生壁合成时期表达ghtt2-3a是转基因成熟纤维呈色的关键为明确ghtt2-3a在棉花纤维pa合成中的调控作用,通过转基因方法对ghtt2-3a进行了功能分析。分别将ghtt2-3a构建在不同发育时期的纤维特异启动子scfp、e6、fbl2a和组成型启动子35s的下游,利用农杆菌介导法对白色棉进行遗传转化。结果表明ghtt2-3a在scfp::ghtt2-3a、e6::ghtt2-3a和35s::ghtt2-3a的转基因棉花发育早期(11dpa)的纤维中表达水平明显提高,同时纤维中pa含量也比野生型增加1-2倍。但在发育后期(22dpa)的纤维中,ghtt2-3a的表达明显下降到几乎和野生型中一样的水平,且转基因纤维中的pa含量也和野生型中无明显差异。这些转基因的成熟纤维最终呈现出和野生型一样的白色。而fbl2a::ghtt2-3a的转基因棉花则相反,其成熟纤维为明显棕色。ghtt2-3a在fbl2a::ghtt2-3a转基因棉花发育早期(11dpa)纤维中几乎不表达,纤维中的pa含量较野生型中也无变化,而在次生壁合成时期,ghtt2-3a在纤维中的表达水平逐渐提高,pa在纤维中合成和积累量也明显增加。这些结果表明,ghtt2-3a在转基因棉花纤维中有促进pa合成的功能,且在纤维发育的后期(次生壁合成期)合成和积累pa是成熟纤维显色的关键。为明确ghtt2-3a上调表达对其它基因的影响,对fbl2a::ghtt2-3a转基因棉花和null系(对照,gus阴性)22dpa的纤维进行了mrna数字表达谱分析。结果表明,与null系相比,转基因棉花纤维中共有170个表达差异的基因,包含149个上调基因和21个下调基因。总共有37个pa合成途径基因被鉴定出,这些基因的表达都明显上调,包含5个ghpal、4个ghc4h、2个gh4cl、5个ghchs、4个ghchi、3个ghf3h、4个ghf3’h、4个ghf3’5’h、2个ghdfr、3个ghlar、2个ghans和2个ghanr。进一步的rt-pcr验证表明这些基因在fbl2a::ghtt2-3a转基因棉花纤维中的表达水平都明显高于null系。此外,2个ghwd40和1个ghtt8同源基因也都上调了3倍以上。这些结果表明ghtt2-3a能上调转基因纤维中的整个pa合成途径,同时对参与pa调控的转录因子也有一定的激活作用。以上研究表明,ghtt2-3a能通过激活整个pa合成途径促进pa在转基因纤维中合成和积累,最终使成熟纤维呈现出明显的棕色。同时根据前期的表达和遗传定位分析,认为ghtt2-3a与控制棕色色素pa合成的棕色纤维基因lc1是同一基因。4.棉花tt8同源基因的鉴定和克隆基于前面的研究,为寻找棉花中与pa调控相关的tt8同源基因,通过在已测序的二倍体棉花(亚洲棉和雷蒙德氏棉)中寻找bhlh的同源基因,最终鉴定出289个棉花bHLH相关的同源基因,并命名为GobHLH001-289。与拟南芥、可可中的bHLH蛋白及一些藓类和藻类中的部分bHLH蛋白的进化分析,共分为30个亚家族,而棉花中的bHLH蛋白被分成27个亚家族。这些bHLH蛋白中,S5a和S5b亚家族和拟南芥第三(Шf)亚家族中参与类黄酮调控的bHLH(如TT8)蛋白的序列相似性最高。这些bHLH的基因编号分别为GobHLH062、GobHLH064、GobHLH110、GobHLH123和GobHLH130。为明确S5a和S5b亚家族的bHLH基因结构,克隆和比较了陆地棉(A、D亚基因组)和它们的祖先二倍体棉(A和D基因组)中所有的S5a和S5b亚家族基因。结果表明,来自二倍体A和D基因组中的10个S5a和S5b亚家族bHLH基因在四倍体棉花中都有保留。其中四倍体棉中有两个序列的发生改变,主要是GhbHLH130D中有一个15bp序列的删除和GhbHLH062A中有一个长末端重复序列的插入。5.GhTT2-3A和GhbHLH110A对PA途径的激活具有协同作用为明确GhTT2-3A和b HLH在棉花PA合成途径中的调控方式,通过烟草瞬时表达系统和双荧光活性检测的方法,检测GhTT2-3A和GhbHLH110A对PA合成途径基因GhDFR、GhLAR和GhANR的启动子激活作用。结果表明,GhTT2-3A和GhbHLH110A分别都能单独激活GhDFR、GhLAR和GhANR启动子的表达,但激活效应均较弱。当GhTT2-3A和GhbHLH110A二者共同作用时,其激活效果明显增强。这些结果表明,在棉花纤维PA的合成中,GhTT2-3A和GhbHLH110A能够协同激活PA合成途径基因。综上所述,本研究中鉴定出了5对能促进PA合成的棉花GhTT2同源基因。其中,GhTT2-3A在棕色纤维中特异性表达,且在纤维发育的不同时期表达GhTT2-3A都能促进纤维中PA的合成和积累,但只有次生壁合成时期表达GhTT2-3A的转基因棉花成熟纤维呈棕色,并获得了转基因棕色棉。结合遗传定位结果,我们认为GhTT2-3A与棕色纤维基因Lc1是同一基因。GhTT2-3A和GhbHLH110A相互协同激活PA合成途径。为进一步研究色素对纤维生长发育的影响的分子机制奠定了基础,同时也为彩色棉育种提供了新材料。