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研究目的碳青霉烯类抗生素具有较强的抗菌活性和较低的副作用,常作为多重耐药的鲍曼不动杆菌最有效的武器,然而,随着碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌的不断出现,已给临床的治疗带来了严峻的挑战。为明确安徽地区临床分离的鲍曼不动杆菌的耐药性,了解碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的流行分布,外排泵基因的分布与碳青霉烯耐药的关系。本研究检测碳青霉烯类水解酶及相关外排泵基因在碳青霉烯类耐药菌株中的分布差异,对主要外排泵基因进行转录组分析,深入探讨碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌与外排泵基因高表达的相关耐药机制,明确安徽省碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的流行克隆株,为预防耐药性的克隆传播提供新的理论依据。研究方法收集安徽地区多家三级医院2015年至2018年每年9月份的非重复的443株临床分离的鲍曼不动杆菌,所有菌株经过安徽医科大学第一附属医院法国生物梅里埃VITEK2-Compact全自动细菌鉴定仪及本实验室的Clin-To F-Ⅱ飞行时间质谱仪鉴定。1.采用琼脂二倍稀释法法测定非重复443株鲍曼不动杆菌对17种常用抗生素的最小抑菌浓度(MIC),应用肉汤稀释法测定鲍曼不动杆菌对替加环素的最小抑菌浓度。2.应用PCR扩增技术对443株碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌携带的碳青霉烯类耐药基因KPC、TEM、ADC、SHV、OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、VIM、IMP-4、NDM和主要外排泵基因ade B、ade J、abe S、mac B、emr B、abe M、Cra A基因进行筛选。3.利用多位点序列分型技术(Multilocus sequence typing,MLST)进行分子分型,并探究碳氢酶类耐药基因和流行克隆株的关系,使用e BURST软件和进化树软件分析菌之间的进化关系。4.经药敏实验和PCR扩增试验筛选出26株临床碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌,应用实时荧光定量RT-PCR检测外排泵基因ade B、ade J、mac B、emr B、abe S、abe M、Cra A的m RNA表达水平。5.应用外排泵抑制剂苯丙氨酸-精氨酸-β-苯胺(PAβN)和羰基氰氯苯腙(CCCP)进行外排泵表型抑制实验。研究结果1.临床分离443株鲍曼不动杆菌除对多粘菌素和替加环素保持较高的敏感率(>90%),对其余16种抗菌药物普遍耐药,其中米诺环素(55%)和头孢哌酮/舒巴坦(56.32%),其他抗菌药物的耐药率均超过了80%。复方新诺明耐药率最高。2.443株临床分离的碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌中,均检出OXA-51,未检测到KPC、VIM、IMP-4、NDM基因,92.1%(408/443)检测到OXA-23,4(0.9%)检测到OXA-24,6(1.4%)检测到OXA-58,282(63.6%)检测到TEM,48(10.9%)检测到SHV,277(62.5%)检测到ADC,其中166(37.5%)MDR-AB携带4种以上的不同的碳青霉烯类耐药基因。另外外排泵基因ade B和abe M的检出率为92.35%,90.21%。ad J、Cra A的检出率分别88.65%、82.75%,外排泵基因abe S、mac B、emr B检出率在80%以上。3.MLST结果显示;443株鲍曼不动杆菌分为36基因型,包括已知ST的88.5%(23/26)和未知ST的80%(8/10)属于CC92克隆群。另外ST195和ST208为安徽地区最主要的ST型。同时系统进化树表明,CRAB分离株分为8个簇,Cluster#1包含4年内检测到的365个主要菌株。4.在转录水平上,26株碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的ade B,ade J和mac B基因的平均表达水平相对于标准菌株分别提高了30,12,2倍。其中替加环素耐药菌株mac B平均提高了5.8倍。5.外排泵抑制剂PAβN和CCCP可提高大部分的碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌对亚胺培南、美罗培南和替加环素的敏感性。结论1.目前安徽地区临床分离的鲍曼不动杆菌大多数为碳青霉烯耐药菌株。因此加强安徽地区抗菌药物的合理使用是非常有必要的。2.安徽地区鲍曼不动杆菌主动外排泵基因有较高的检出率,且在鲍曼不动杆菌多重耐药中发挥重要的作用。3.研究结果显示,安徽地区碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的流行主要为CC92克隆复合体,OXA-23基因可能是其克隆传播的重要因素之一。4.在安徽地区替加环素耐药的鲍曼不动杆菌中发现了mac B外排泵基因高表达,有关mac B基因的调控机制有待进一步研究。