论文部分内容阅读
[目的]研究不同亚型的乳腺癌细胞中hNav1.5钠离子通道的表达水平,验证hNav1.5表达量的不同与乳腺癌恶性程度之间的相关性;在此基础上,通过重组小分子肽-BmKM9特异性抑制hNav1.5钠离子通道,研究其在乳腺癌细胞中所起到的生物学功能及相关作用机制。为乳腺癌的防治奠定基础。[方法]1.构建原核表达载体,将BmKM9的cDNA序列克隆入载体,利用重组大肠杆菌X1X5X4BH-28a-BL21(DE)3诱导蛋白的表达。再通过镍柱、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)纯化蛋白,用 rTEV 蛋白酶去除蛋白的融合头,得到高度纯化的重组BmKM9。2.培育不同亚型的乳腺癌细胞,提取蛋白,利用Western Blot(WB)对不同样本中hNav1.5的含量进行分析。根据hNav1.5的表达量,选择高表达的细胞株。3.采用全细胞膜片钳技术(Patch Clamp Recording Technique,PCRT)测定BmKM9对乳腺癌细胞MDA-MB-231中钠电流的影响。4.BmKM9与乳腺癌细胞共孵育,用MTT法、划痕法、侵袭实验、PI/FITC等检测BmKM9对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及细胞周期的影响。5.培养高表达hNav1.5的乳腺癌细胞株,加BmKM9孵育处理,利用QPCR列阵(QPCRArray)定量分析BmKM9影响该细胞信号通路中的蛋白变化,比较加药处理组和空白组之间mRNA表达水平的差异;根据这些差异性表达的基因,选择对应信号通路的相关蛋白抗体,从蛋白水平上再次验证,明确BmKM9发挥生物学功能的主要的信号通路。6.在裸鼠体内构建乳腺癌原位移植模型,将15只裸鼠随机分成3组,每组5只,分别设置为对照组(Control Group,注射生理盐水)、雷诺嗪组(Ranolazine Group,50mg/kg)(阳性对照)、BmKM9(1mg/kg)组,连续给药1月,完整剥离肿瘤,利用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)及免疫荧光半定量检测不同组间肿瘤样本中Ki67含量的差异。[结果]1.WB结果显示,hNav1.5在正常的乳腺细胞和侵袭能力弱的乳腺癌细胞中不表达或低水平表达,而在侵袭能力强的三阴性乳腺癌细胞(Triple Negative Breast Cancer,TNBC)中如:MDA-MB-231 呈现高表达。2.1μM的BmKM9能够显著抑制MDA-MB-231细胞hNav1.5钠离子通道的电生理活动,02μM的BmKM9对乳腺细胞/乳腺癌细胞的增殖没有明显的促进或抑制作用。.0625μM3.1μM的BmKM9处理后的MDA-MB-231细胞,其迁移和侵袭能力均显著降低。4.BmKM9对细胞周期和凋亡没有影响。5.qPCR列阵(qPCRArray)定量分析结果显示:与空白组相比,加BmKM9处理后的乳腺癌细胞中不少基因的mRNA水平出现了明显的上调或下调,统计分析后发现,这些差异性表达的基因大多集中在WNT通路;用WNT通路中的一些抗体再次验证相关蛋白,发现加BmKM9处理后的MDA-MB-231细胞中β-catenin蛋白的表达含量显著下调。6.在乳腺癌原位移植的动物模型中,Control(注射生理盐水)组、Ranolazine(50mg/kg)组、BmKM9(1mg/kg)组,观察记录1月后,瘤体积:Control组较Ranolazine组、BmKM9(1mg/kg)组大,肿瘤重量和体积变化一致。肿瘤样本免疫荧光结果显示:与Control组相比,Ranolazine组和BmKM9(1mg/kg)组中Ki67的含量明显降低。[结论]在恶性程度高、侵袭力强的乳腺癌细胞中hNav1.5高表达,提示与乳腺癌的预后相关;从蝎毒素中分离纯化出来的小肽-BmKM9,能够特异性抑制hNav1.5离子通道,降低乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力,小鼠体内注射BmKM9可以抑制乳腺癌肿瘤的生长;BmKM9能够下调β-catenin来抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活,从而降低乳腺癌细胞的转移能力。至于BmKM9是如何通过抑制hNav1.5的电活动从而影响WNT/β-catenin通路的作用机制尚不明确,仍需进一步探索。