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皮肌炎(dermatomyositis,DM)是一种主要累及皮肤和骨骼肌的自身免疫性结缔组织病,死亡率高,并发症多,危害大。DM的临床西医治疗以糖皮质激素和免疫抑制剂为主,疗效有限,毒副作用大,依赖性强;中医辨证施治有优势;皮肌炎常见症候有肝郁,脾虚,血热,根据疏肝,健脾,凉血治则,选用出自明代薛己《内科摘要》的加味逍遥丸经方,其中含有的柴胡皂苷a,阿魏酸,芍药苷,苍术酮,丹皮酚等单体具有抗炎抗过敏和免疫调节作用。地乌为毛茛科银莲花属植物林荫银莲花的根茎,临床治疗自身免疫病效果满意;本课题在前期工作基础上,从抑制巨噬细胞JAK2-STAT3通路,探讨地乌增强加味逍遥丸抑制皮肌炎免疫亢进的免疫药效及药理。1.皮肌炎大鼠模型建立[目的]建立皮肌炎大鼠药效学模型。[方法]SD大鼠48只随机分为对照组和不同条件造模组共6组,除对照组外,其它造模大鼠于dd0,d7,d14,d28膜抗原致敏,d42,d49,d56,d63膜抗原发敏,d77各组分别给予二氢睾酮,右旋糖酐铁,多粘菌素或三药联合,对照组同步给予生理盐水,建立皮肌炎大鼠模型。d91处死动物,以症状评分观察机能变化,HE及von kossa染色观察肌肉,皮肤病理改变;ELISA检测血清抗体(Jo-1/MDA5)与细胞因子(TNF-α/IFN-γ)。[结果]各造模组出现明显肌无力症状,血清中抗Jo-1抗体,抗MDA5抗体,TNF-α,IFN-γ均有不同程度升高;肌肉组织有不同程度的淋巴细胞浸润,多粘菌素组和三药联用组可见显著血管钙化,其中三药联用组病变最为明显。[结论]以膜蛋白诱导自身免疫损伤,环境毒物诱导钙化防御,优化了大鼠皮肌炎的造模条件;该模型符合临床发病,可用于药效评价。2.地乌增强加味逍遥丸防治大鼠皮肌炎的免疫药效[目的]探讨地乌增强加味逍遥丸防治大鼠皮肌炎的免疫药效。[方法]108只SD大鼠雌雄各半,分为对照组,模型组,他克莫司组,地乌组,加味逍遥丸组,加味逍遥丸含地乌组,每组18只;除对照组外,其余造模动物d0,d7膜蛋白致敏,d28,d32,d35,d38,d42发敏,d63给药二氢睾酮,右旋糖酐铁,多粘菌素,建立皮肌炎模型,d28开始每日灌胃给药,他克莫司(0.0056～176.71mg·kg-1·d-1,k=3.16),地乌(1.06～1060.23 mg·kg-1·d-1,k=3.16),加味逍遥丸(1.83～18173.79 mg.kg-1·d-1,k=3.16),加味逍遥丸含地乌(2.81～27919.42 mg·kg-1·d-1,k=3.16),d70处死动物,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察肌肉病理变化,形态计量T淋巴细胞浸润体积比;钙化结节染色(von kossa staining)观察皮肤钙化防御,形态计量钙化结节体积比;免疫组化法检测肌肉切片foxp3,IL-17RA,JAK2,STAT3表达量;各指标用Graphpad Prism 5软件非线型可变斜率回归不同药物的半数有效剂量(median effective dose,ED50),确定方剂药效。[结果]各给药组防治皮肌炎呈剂量依赖趋势,量效曲线呈“S”型。复方及其单体组显著缓解肌肉T淋巴细胞浸润比,钙化结节体积比,增高肌肉中foxp3表达量,降低IL-17RA,JAK2,STAT3表达量。以地乌剂量为标识,与地乌组相比,加味逍遥丸加地乌组曲线左移,T淋巴细胞浸润体积比,钙化结节体积比,IL-17RA表达量,Foxp3表达量JAK2表达量,STAT3表达量ED50是地乌组的0.70倍,0.44倍,0.74倍,0.81倍,0.35倍,0.60倍;以加味逍遥丸剂量为标识,与加味逍遥丸组比,同等剂量下加味逍遥丸加地乌组曲线左移,T淋巴细胞浸润体积比,钙化结节体积比,IL-17RA表达量,Foxp3表达量,JAK2表达量,STAT3表达量ED50是加味逍遥丸复方组的0.63倍,0.72倍,0.71倍,0.68倍,0.48倍,0.71倍;以上结果提示配伍地乌对方剂有增效作用。[结论]地乌能增强加味逍遥丸复方治疗皮肌炎,且具有剂量依赖性,可能通过调节免疫防治皮肌炎。3.地乌增效加味逍遥丸防治皮肌炎的免疫药理[目的]探讨地乌增效加味逍遥丸防治皮肌炎的免疫药理。[方法]60只SD大鼠分为对照组,模型组,他克莫司组,加味逍遥丸加地乌复方低中高剂量组;除对照组外,其余动物d0,d7膜蛋白致敏,d28,d32,d35,d38,d42发敏,d63给药二氢睾酮,右旋糖酐铁,多粘菌素,建立皮肌炎模型,d28开始每日灌胃给药他克莫司(3.12mg·kg-1·d-1)复方低(664.56mg.kg-1·d-1),复方中(2100.00mg·kg-1·d-1),复方高(6636.00mg·kg-1·d-1),d70 处死动物,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE staining)染色观察肌肉病理变化,形态计量T淋巴细胞浸润体积比;钙化结节染色(von kossa staining)观察皮肤钙化,形态计量钙化结节体积比;ELISA法检测血清中促炎因子TNF-α,IL-1β的含量;采用免疫组化法测定脾脏CCR2,肌肉和脾脏foxp3表达量,实时定量RT-PCR和Western blot法检测肌肉和脾脏JAK2,STAT3表达水平;免疫组化和Western blot法检测肌肉和脾脏pSTAT3表达水平及其入核比。[结果](1)药效观察:①大体观察:与模型组比,各给药组均不同程度上改善大鼠四肢红肿,肌无力等DM临床表现②病理观察:与模型组比,各给药组明显改善大鼠肌肉组织束周萎缩,肌细胞变性坏死情况,各给药组均能显著抑制T淋巴细胞浸润;③钙化结节体积比:与模型组比,各给药组不同程度地抑制皮下组织钙化结节生成;与FK506比,复方低中高剂量组无差异;④TNF-α:与模型组比,各给药组不同程度减少血清TNF-α水平;⑤IL-1β:与模型组比,各给药组不同程度减少血清IL-1β的释放;与FK506组比,复方中高剂量组无差异。(2)机制初探:①CCR2:脾脏IHC显示,与模型组比,各给药组不同程度降低CCR2原位蛋白表达,其中复方低中高剂量组CCR2原位蛋白表达显著降低,与FK506组比无差异;②JAK2:在肌肉和脾脏组织中,IHC,RT-PCR,Western blot显示,与模型组比,各给药组不同程度下调巨噬细胞 JAK2 基因和蛋白水平③STAT3:在肌肉和脾脏组织中,IHC,RT-PCR,Westem blot显示与模型组比,各给药组不同程度下调巨噬细胞STAT3基因和蛋白表达④pSTAT3入核比:肌肉IHC显示与模型组比,各给药组不同程度降低pSTAT3入核比,复方中剂量显著降低pSTAT3入核,与FK506比无差异。[结论]加味逍遥丸含地乌复方通过下调巨噬细胞JAK2-STAT3通路抑制T细胞增殖活化,恢复免疫平衡防治皮肌炎。