组织因子(tissue factor, TF),又称凝血因子Ⅲ(Coagulation factorⅢ),最初被认为是外源性凝血过程的起始因子,当组织因子暴露于血浆蛋白时,TF通过与其有高亲和力的凝血因子Ⅶ(factorⅦ,FⅦ)相结合,进而进一步激活血液凝固级联反应,发挥止血作用。近来的研究发现,在很多疾病中,如败血症,心肌纤维化,动脉粥样硬化,肿瘤,子宫内膜异位症,抗磷脂抗体综合征,急、慢性炎症等,组织因子均表达异常,提示组织因子还发挥着其它的重要功能。由于TF的基因敲除导致哺乳动物的胚胎致死或出生后不久死亡,难以深入研究其在胚胎发育中的作用。斑马鱼是近年来出现的一种良好的模式生物,其体型较小可以通过渗透作用提供氧气和营养,所以即使心血管有严重的畸形也可以存活较长的时间。此外斑马鱼胚胎发育期,通体透明便于观测,且心血管发育在进化上与哺乳动物具有高度的保守性,因此斑马鱼被认为是研究心血管早期发育良好的模式生物。所以利用斑马鱼研究TF在心血管系统发育中的作用具有独特的优势。在斑马鱼中,TF基因有两个同源基因组成：凝血因子Ⅲa(Coagulation factorⅢa, f3a)与凝血因子Ⅲb (Coagulation factorⅢb, f3b)。目前,NCBI上仅报道了凝血因子Ⅲa的预测的cDNA序列,表明其cDNA序列尚未确定,而凝血因子Ⅲb基因序列已被Stein等报道[36],且通过与人类、小鼠、大鼠和牛的组织因子(TF)的蛋白序列比对,发现其主要的功能域结构高度保守。因此,我们选择凝血因子Ⅲb为研究的靶基因,本文主要研究了f3b在斑马鱼胚胎发育中的作用。本文第一部分：利用生物信息学的方法证明f3b在脊椎动物的进化过程中,结构和蛋白的功能结构域上较为保守。并且用RNA全胚胎原位杂交的方法和RT-PCR技术对f3b基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中表达谱进行了研究。本文第二部分：我们设计了两个吗啡啉修饰的反义寡核苷酸,ATG-MO与SPL-MO,分别干扰f3b翻译起始位点与剪切位点,建立了f3b基因表达下调的斑马鱼模型。两种f3b-MO得到同一个表型：在胚胎发育早期,主要是在24 hpf(受精后24小时)---36 hpf,第四脑室明显水肿；在胚胎发育晚期,主要在36 hpf---72 hpf,斑马鱼发生血细胞外渗,主要位于头部,咽部等。这证明了f3b-MO的特异性。为了验证吗啡啉修饰的反义寡核苷酸的有效性,我们将其与编码f3b-EGFP融合蛋白的f3b-EGFP DNA共注射,结果显示f3b-MO抑制了f3b-EGFP融合蛋白的表达,从而也验证了f3b-MO能够有效抑制内源性的f3b的表达。本文第三部分：用显微荧光造影和原位杂交检测f3b基因表达下调后血管的发育情况。血管标志基因flk-1的RNA探针原位杂交表明f3b基因表达下调的斑马鱼胚胎血管出现异常：位于内细胞团(ICM)的表达下调,形态异常。ICM相当于哺乳动物的卵黄囊,位于斑马鱼脊索和躯干中胚层之问,含有原始造血细胞的前体。另外,我们通过显微荧光造影检测斑马鱼胚胎发育后期血管的变化,发现f3b基因表达下调的斑马鱼胚胎在48 hpf体节处血管出现串珠样改变,在72 hpf在正常的血管外可见血细胞的外渗。这说明,f3b对斑马鱼胚胎血管形态的正常形成非常重要。本文第四部分：用原位杂交检测f3b基因表达下调后神经系统的发育情况。神经胶质细胞标志基因olig2的表达f3b基因表达下调的斑马鱼胚胎明显减少,而神经元细胞的标志基因Huc的表达基本一致,这说明f3b特异地影响胶质细胞的发育。本研究证明：f3b在胸鳍和咽部有明显表达。f3b基因表达下调导致第四脑室水肿和斑马鱼不同部位的出血。原位杂交显示f3b基因表达下调后斑马鱼胚胎flkl的表达异常,荧光造影显示f3b基因表达下调后斑马鱼胚胎的血管先发生形态改变再发生出血。因此可以认为f3b是斑马鱼胚胎早期正常血管形态形成所必需的。