NMDA受体(NMDAR)是中枢神经系统(Central nerve system, CNS)最重要的离子型谷氨酸能受体之一,NMDAR的持续开放后能介导兴奋性神经突触后的去极化,以及胞内钙离子的爆发式增加,下游激酶磷酸化等信号通路打开的连锁式反应,这就决定了NMDAR在生理和病理情况下均具有极其重要的作用。在生理条件下,当突触后NMDAR激活时,钙离子通过NMDAR从胞外进入胞内,介导活动依赖的长时程突触传递效能改变,产生一系列电生理改变,如长时程增强(Long-term potentiation, LTP)和长时程减弱(Long-term depression, LTD)。目前认为NMDAR依赖的LTP/LTD是参与学习和记忆的重要分子机制之一。在病理条件下,NMDAR过度激活,ATP供给缺乏,细胞内外离子浓度梯度丧失,兴奋性神经递质如谷氨酸超量释放,钙离子超载,下游凋亡信号通路程序性打开,各种蛋白激酶、蛋白酶激活,线粒体等细胞器坏死,最终导致神经元变性、损伤和／或死亡。NMDAR的过多兴奋被认为是参与CNS各种变性坏死疾病(如Alzhemer病,Parkingson病,缺血性脑梗死等)的最重要病理特征之一。甘氨酸(Glycine)以往一直被认为是除了GABA以外最重要的抑制性神经递质。甘氨酸在CNS中有广泛的分布,在神经信号的传递以及参与各种生理和病理反应中起着的重要基础作用。但是,越来越多证据表明,在神经递质的特性上甘氨酸有双重作用,一方面它是NMDAR的共激动剂,结合NMDAR上的共激活位点,又称B位点,发挥兴奋性作用；另一方面它是CNS中一类主要的抑制性神经递质,激活甘氨酸受体,即A位点,发挥抑制性作用。我们实验室的最新研究表明,甘氨酸可浓度依赖地诱导双向可塑性。甘氨酸在低浓度时,主要激动NMDA受体上的结合位点,诱导产生LTP；甘氨酸在高浓度时,主要通过激动甘氨酸受体,诱导产生LTD。此外,甘氨酸诱导的双向可塑性均依赖于NMDAR的活性。上述前期研究结果为本课题进一步探求甘氨酸对伴随脑缺血出现的病理性可塑性的作用,以及对学习记忆的可能作用打下了坚实理论基础。1.甘氨酸对脑缺血的双向调节作用脑缺血(Cerebral ishaemia)是临床最主要的神经系统疾病,中风(Stroke)早已被世界卫生组织定义为急待攻克的人类重大疾病。神经元保护一直是脑缺血研究最重要的方向。干预神经元介导的突触传递过度兴奋则是神经元保护的关键。早期很多研究表明局部缺血能够引起短时间内多种氨基酸释放的增加,其中甘氨酸的增加是重要表现之一。甘氨酸是否参与脑缺血的发生发展?是起核心作用还是伴随显现?甘氨酸对缺血性神经损伤究竟是保护作用还是损害作用?关于这些问题仍然存在很多争议,并且其中的分子机制还不清楚。在生理状态下,LTP为长时程突触传递效能的改变,是调节神经元兴奋性突触传递的基本机制。我们实验室的前期研究表明,Gly可浓度依赖地诱导双向可塑性。而在脑缺血这种病理状态下,缺血可导致病理性可塑性(Post-ischemic LTP, i-LTP)的产生,以及脑梗死灶的出现。那么甘氨酸在这种病理情况下是如何发挥作用的?这是一个重要的科学问题。本课题第一部分内容采用离体脑片短暂缺氧缺糖处理(Oxygen and glucose deprivation, OGD)以模拟脑缺血后神经元损伤,建立经典的体外脑缺血模型,结合全细胞膜片钳(Patch clamp)方法记录大鼠海马CA1区锥体神经元兴奋性突触后电流(Excitatory postsynaptic currents, EPSC),短时间给予OGD处理后,能诱导i-LTP,若同时给予不同浓度的甘氨酸灌流脑片,可观察其对i-LTP的影响；另一部分实验采用在体大鼠大脑中动脉阻塞手术(Middle cerebral artery oclusion, MCAO)构建在体脑缺血模型,在模拟缺血再灌注神经损伤后,分别腹腔注射不同浓度的甘氨酸,观察脑梗死灶的变化来判断甘氨酸对脑缺血的可能影响。实验结果表明,甘氨酸对病理可塑性i-LTP具有浓度依赖的双向调节作用。外源性给予低浓度的甘氨酸能够增加i-LTP的幅度,并且MCAO实验能够进一步增大缺血梗死区,而高浓度外源性甘氨酸可以抑制i-LTP,并且能够减小缺血梗死区,这些结果提示低浓度的外源性甘氨酸对缺血神经元有损害作用,而高浓度甘氨酸有保护作用。通过灌流不同浓度的甘氨酸转运体(Glycine transporter, GlyT)阻断剂,模拟不同程度的内源性甘氨酸增加,同样能观察到类似的双向作用的现象。进一步研究发现,低浓度甘氨酸的损害作用是通过结合NMDAR上的甘氨酸结合位点实现的；而H-Gly的保护作用则是通过激活甘氨酸受体,继而调节NMDAR亚基组成实现的。此外,我们采用在体微透析(in vivo microdialysis)联合MCAO实验,准确的分析出了脑缺血前后给予不同浓度的外源性甘氨酸后海马区胞外甘氨酸浓度的实际变化。以上结果提示甘氨酸在浓度较高时对脑缺血具有保护作用,甘氨酸受体有可能成为临床脑中风的研究提供新的治疗靶点。该研究为阐明脑缺血坏死的发病机理以及临床治疗脑梗死提供必要的实验依据。2甘氨酸对空间记忆的双向调节作用学习记忆及其机制一直都是神经生物学的研究重点之一。长期记忆则是学习记忆研究中的核心问题。长期空间记忆(Spatial memory)与其它类型的长期记忆一样,可分为获得(Acquisition或Encoding)、巩固(Consolidation)及提取(Retrieval或Recall)三个阶段。LTP及LTD被认为是重要的学习和记忆的分子机制。大量文献表明,LTP及LTD与空间记忆紧密相关。药理学和遗传学的证据都揭示海马NMDAR的活性和NMDAR依赖的突触可塑性(LTP/LTD)在动物空间记忆的获得、巩固和提取阶段都起着关键作用,在记忆的获得之前以及记忆的巩固和提取阶段阻断NMDAR的作用、或敲除NMDAR的核心亚基基因(如NR1,NR2A,NR2B),都将妨碍动物长期空间记忆的形成。如前所述,甘氨酸可分别通过其NMDAR结合位点及GlyR的介导,诱导产生LTP及LTD。那么甘氨酸能否对海马依赖的空间记忆的各个阶段发挥作用?如何发挥作用?是否该作用也有浓度依赖的特点?这些问题是本课题第二部分的研究重点。本实验采用,用在体行为学方法(Morris水迷宫)联合离体电生理全细胞膜片钳方法记录CA1区锥体神经元EPSC,分别在学习记忆的不同时段给予不同剂量的甘氨酸,观察空间记忆各阶段行为学变化。结果表明,外源性给予低浓度的甘氨酸对空间记忆的巩固和提取有增强作用；而给予高浓度甘氨酸对空间记忆以及记忆的巩固和提取有抑制作用。高浓度甘氨酸对空间记忆巩固与提取的抑制作用是通过甘氨酸受体实现。总之,甘氨酸对大鼠海马依赖的空间记忆有双重作用,即低浓度是增强记忆,而高浓度时损害记忆。甘氨酸受体有可能成为临床干预学习记忆损伤的新靶点。