宿主昆虫在与病原微生物长期斗争的过程中，进化出来一系列与植物、动物相似的固有免疫应答反应来抵抗病原微生物的感染。昆虫的固有免疫应答反应主要包括：体壁的机械屏障作用、体液免疫和细胞免疫。昆虫病原真菌是昆虫重要的致病菌，病原真菌通过在宿主昆虫体表附着和萌发启动侵染，病原真菌一旦穿透宿主昆虫体壁，即可以快速播散形成感染。因此，病原真菌与宿主昆虫之间的斗争犹如“矛和盾”的关系，病原真菌侵染宿主昆虫的结果转归主要由宿主昆虫的固有免疫应答反应和病原真菌致病力之间的相互作用决定。详细阐明宿主昆虫抵抗真菌感染的固有免疫应答机制对于寻找更加有效的杀虫靶标和开发更加高毒的工程真菌菌株以及设计害虫防治策略具有极其重要的意义。　　 以往研究多认为宿主昆虫的固有免疫应答反应发生在真菌侵染穿透宿主昆虫体壁的皮细胞层(epidermis)时，而本研究的前期研究发现，在病原真菌绿僵菌侵染东亚飞蝗的早期(6-24小时)，感病蝗虫体内出现大量基因发生表达变化，这就提示宿主昆虫对病原真菌的固有免疫反应的起始时间可能比我们想象的更早。另外，脂肪体和血细胞是被普遍承认的重要的固有免疫应答器官，但近年来也有文献报道体壁、中肠等组织中也有免疫相关基因的表达，但究竟有哪些组织参与宿主昆虫抵抗真菌感染目前尚无系统性研究。　　 Toll信号通路是宿主昆虫固有免疫应答反应中重要的体液免疫信号途径。Toll信号通路是存在于从低等的线虫到高等的哺乳动物中的一条保守信号通路，该通路在昆虫体内可同时参与抵抗真菌和革兰氏阳性细菌的感染。另外，酚氧化酶系统是宿主昆虫固有免疫应答反应中重要的细胞免疫途径。β-1，3-葡聚糖识别蛋白(βGRP)是酚氧化酶系统上游主要识别真菌细胞壁成分β-1，3-葡聚糖的重要受体，βGRP对于β-1，3-葡聚糖的识别可以引起下游的酚氧化酶系统活化，进而调控昆虫血细胞参与包裹和黑化病原微生物。对按蚊的研究发现，利用RNA干扰沉默βgrp基因后可以使得酚氧化酶信号通路激活障碍，进而抑制血细胞对细菌的黑化包裹作用，并导致按蚊的存活率降低；但是，对果蝇的研究却发现，将酚氧化酶信号通路中的酚氧化酶激活酶沉默后使得酚氧化酶激活障碍后，突变的果蝇仍和野生型果蝇一样能够抵抗真菌的感染，这就说明在果蝇中βGRP也可能并不参与抵抗真菌。由此可见，βgrp却基因在不同的物种中功能较为复杂。　　 由此可见，近年的研究已经阐明了昆虫防卫真菌的多个信号途径，但还未完全弄清昆虫对真菌的防卫反应时间、空间、参与的组织器官以及各种信号途径在防卫中的作用。想要了解主昆虫何时以及如何启动固有免疫应答反应以及哪些组织参与抵抗真菌，可以通过分析Toll信号通路在抵抗真菌感染的过程中的激活时间和参与的组织器官进行探讨。但是，Toll信号通路涉及的相关基因较多，如果要对宿主昆虫启动Toll信号通路的时空特点进行深入的研究，则需要从真菌孢子侵染早期至末期对昆虫的多个免疫组织中Toll信号通路的变化进行研究，这样形成的检测样本数量就会较多。因此，本研究首先建立了一种有效检测多个基因在多个样本中表达谱的方法，再以绿僵菌侵染直翅目昆虫东亚飞蝗为材料，从绿僵菌孢子在体壁萌发至侵染晚期，动态系统地研究了东亚飞蝗体内四个不同组织(脂肪体、血细胞、中肠和翅)中Toll信号通路相关基因的激活时间和表达变化情况，同时研究了通路中两个重要基因Lmmyd88和Lmcactus的转录被干扰下调后东亚飞蝗抵抗真菌感染能力的变化情况。　　 另外，本研究还首次克隆了直翅目昆虫东亚飞蝗体内的βgrp基因，检测了该基因在东亚飞蝗体内不同组织和不同发育时期的表达情况，研究了该基因在宿主昆虫东亚飞蝗感染真菌后的表达变化情况，同时还研究了通过RNA干扰使得该基因的转录下调后，宿主昆虫东亚飞蝗的存活率的改变以及抵抗真菌感染能力的变化。　　 主要研究结果有：　　 1)建立了一种有效的检测多重基因表达谱的技术，该技术不需要特殊仪器、操作简便、成本低、灵敏度好，特别适合中等通量的基因表达谱检测，该技术满足后续实验要求。　　 2)克隆了东亚飞蝗体内Toll信号通路相关基因片段，包括：2个模式识别受体Lmgnbp-like和Lmgnbp2，6个Toll信号通路相关基因Lmspatzle、Lmtoll9、Lm18wheeler、Lmmyd88、Lmtube和.Lmcactus。　　 3)半定量RT-PCR显示，上述8个基因在中肠中均有较高水平的表达，而脂肪体、血细胞和翅中表达则相对较低，另外，Lmspatzle基因只在翅和中肠中有表达，而在脂肪体和血细胞中无表达，Lmtoll9基因则只在中肠中有表达。　　 4)Real-time PCR结果显示，绿僵菌侵染东亚飞蝗后，当绿僵菌在东亚飞蝗的翅表皮上萌发(侵染后8h)时，脂肪体中的Toll通路相关基因即呈上调表达。　　 5)多基因表达谱检测方法分析翅、脂肪体、血细胞和中肠四个免疫器官中。Toll信号通路相关基因激活情况，结果显示，当绿僵菌在东亚飞蝗的翅表皮上萌发时，脂肪体中的Toll通路相关基因仍呈上调表达，结果与利用Real-time PCR检测的结果一致；同时，模式识别受体Lmgnbp-like和Lmgnbp2在翅中有上调表达，血细胞和翅中的Toll信号通路基因也呈上调表达，但时间晚于脂肪体中Toll信号通路相关基因的活化时间；但中肠中的Toll通路相关基因在真菌侵染的整个过程中未见明显改变。　　 6)RNA干扰实验研究结果显示，Toll信号通路基因Lmmyd88和Lmcactus转录下调后，东亚飞蝗抵抗真菌感染的能力发生了改变，Lmmyd88突变体抵抗真菌的能力下降，而Lmcactus突变体抵抗真菌的能力提高。　　 7)克隆获得了β-1，3-葡聚糖识别蛋白基因(命名为Lmβgrp)，该基因全长cDNA为1656bp，预测蛋白分子量为53kD。　　 8)半定量RT-PCR检测结果显示，生理状态下，Lmβgrp却在胚胎发育的整个阶段都有表达，但在成虫中仅在血细胞中有表达，而在脂肪体、中肠和翅等免疫器官中均无表达。　　 9)定量PCR结果显示，真菌侵染东亚飞蝗后，Lmβgrp基因及下游酚氧化酶信号通路中酚氧化酶蛋白基因(Lmppo)的转录被诱导上调。　　 10)RNA干扰实验研究结果显示，通过RNA干扰沉默Lmβgrp基因的转录后，东亚飞蝗的存活率低于未被干扰的野生组，且干扰组东亚飞蝗粪便出现异常的黑色稀便；感染真菌绿僵菌后，干扰组东亚飞蝗的存活率低于感染了绿僵菌的野生型东亚飞蝗。　　 11)分析检测东亚飞蝗肠道16s rRNA，发现Lmβgrp基因转录被干扰后，东亚飞蝗的肠道菌群种群发生改变，干扰组东亚飞蝗肠道内检测到了异常的创伤弧菌(Hbrio vulnificus)。　　 以上实验结果说明，直翅目昆虫东亚飞蝗体内也存在保守的固有免疫应答信号途径Toll信号通路，且该通路是东亚飞蝗体内重要的抗真菌感染的信号途径，宿主东亚飞蝗在真菌穿透体壁之前就能感知真菌在体表的萌发，进而快速激活体内多个组织(脂肪体、血细胞和体壁组织)中的Toll信号通路参与抵抗真菌的感染。另外，东亚飞蝗体内也保守存在模式识别受体β-1，3-葡聚糖识别蛋白基因Lmβgrp，该基因参与抵抗真菌感染；同时，Lmβgrp也可能参与宿主昆虫东亚飞蝗的肠道固有免疫应答反应。