前言卵巢上皮癌来源于卵巢上皮细胞,目前,对其发生癌变的分子生物学机制还不是十分明确。由于其发生存在遗传复杂性及基因突变多元性,为此,本研究应用了一个新的细胞体系,该体系以逆转录病毒为载体,将多种确定可引起遗传突变的一系列常见癌基因转染到p53基因敲除的雌性成年大鼠的卵巢表面上皮细胞内。要生成这种具有遗传定义的卵巢上皮癌细胞系,通过将编码人类c-myc原癌基因,鼠K-rasG12D以及HA标记的鼠十四(烷)酰化Akt-1癌基因转染到由K5-TVA-p53敲除的大鼠分离出的卵巢上皮细胞内。根据目前的研究结果已证实,单独转染c-myc, K-ras或Akt基因其中的一种,并不能使p53敲除的大鼠卵巢表面上皮细胞发生转变,然而,转染至少这三个癌基因中的任意两种,可使卵巢表面上皮细胞表型发生癌变。大鼠卵巢癌细胞系的生成如下：C1(基因型：p53-/-, c-myc, K-ras), C2(基因型：p53-/-,c-myc, Akt), C3(基因型：p53-/-,K-ras,Akt)。将C1,C2和C3细胞注射于裸鼠腹腔内,所有结果表明其形成的腹腔扩散癌组织与女性Ⅲ期卵巢癌非常相似。同时,与人卵巢癌相似的是,肿瘤很少发生肝脏或脾脏转移,而只局限于腹腔,松散的附着于腹膜表面、肠系膜和生殖器官。组织学显示,来自Cl和C2细胞的腹腔肿瘤类似卵巢浆液性乳头状癌,这是女性卵巢癌最常见的类型。来自C3细胞所产生的肿瘤类似低分化卵巢癌。由C1，C2和C3来源的肿瘤结节分离后,进行体外培养,形成T1,T2和T3肿瘤细胞系。K-ras原癌基因是RAS基因家族成员之一,致癌谱广泛,活化多发生于卵巢癌的早期且同组织类型有关。近年对激素受体的研究发现激素信号系统和Ras的信号通路存在相互作用,Zacchos等在人卵巢癌和子宫内膜癌组织中发现类固醇激素可直接活化Ras原癌基因,因而Ras在人类激素依赖性肿瘤发生发展中亦起重要作用。Akt是存在于人类染色体中的鼠类胸腺瘤病毒(Akt-8)致癌基因的同源物,已被定义为癌基因,因其蛋白质产物的激酶活性区的氨基酸序列与蛋白激酶A(PKA)和C (PKC)有高度的同源性,又被命名为PKB。Akt/PKB是PI3K信号转导途径中一个重要的下游靶激酶,具有丝/苏氨酸激酶活性。PI3K/Akt通路是一个经典抗凋亡促存活的信号转导途径,在肿瘤发生增殖、侵袭转移及化疗耐药中发挥重要作用。目前,我们的前期研究结果已表明,在卵巢上皮癌组织中,铂类药物的原发性耐药可能与PI3K/Akt信号通路异常活化有关。而本研究也将继续对与该信号转导通路相关的内容进行进一步研究。姜黄素(Curcumin, Cur)是从姜科姜黄属植物的根茎中提取的一种酚类色素,其主要药理作用包括抗炎、抗氧化、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗病毒等,且毒性较低。Cur的抗肿瘤作用目前已得到共识,但是关于Cur干预卵巢癌细胞生物学行为的具体机制国内外文献报道较少。转基因细胞系作为一个较为理想的体系,不仅可以用于检测肿瘤生长维系所必需的独立通路,同时可以探究肿瘤对于通路靶向治疗的敏感性的分子机制。本研究通过应用T3 (p53-/-,K-ras,Akt)肿瘤细胞系,观察Cur对T3细胞系增殖的抑制情况及肿瘤迁移能力的影响,同时对所转染的癌基因Akt及其活化形式磷酸化Akt(p-Akt)和K-ras蛋白表达,以及对PI3K/Akt通路中重要环节PI3K蛋白的检测,从而探讨Cur可能存在的抗癌作用的分子生物学机制。实验方法1、T3细胞系的培养和鉴定在37℃,5%C02,正常氧浓度,饱和湿度条件下,10%的胎牛血清,DMEM培养基培养T3细胞至对数生长期。Western blot检测正常培养24小时的T3细胞中Akt、K-ras及p-53蛋白的表达情况。2、T3细胞系增殖的检测(1)用0.25%的胰蛋白酶消化对数期生长的细胞,悬浮于含10%胎牛血清的DMEM培养液中。(2)以1×105/ml细胞接种于96孔培养板,培养24h后,分别加入含不同浓度姜黄素的DMEM培养液100μl,使姜黄素的终浓度为10,20,40,80μmol/L。同时设阴性对照组、空白对照组,阴性对照组不加姜黄素只加培养液,空白对照组不加细胞只加培养液,每组设5个复孔；(3)培养48 h后,每孔加入5 mg/ml MTT 20μl,继续培养4h后,吸去上清液,加入150μlDMSO溶液,震荡培养板10min,用酶标仪检测OD值,检测波长为490nm；细胞增殖抑制率(%)=[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)]×100,求得IC5o。以浓度为20μmol/L的Cur,分别作用0,6,12,24,48h,方法步骤同浓度组。3、T3细胞系迁移能力的检测(1)细胞悬液制备：细胞培养瓶中培养细胞,取对数生长期的细胞用于实验,于无血清DMEM中培养12h后,PBS清洗3次,用1.5 ml、0.25%胰蛋白酶消化细胞,待细胞变圆将要从培养瓶壁脱落时,倒去多余的胰蛋白酶,加入3ml培养基,将细胞从培养瓶壁上吹落并分散成单细胞悬液,进行细胞计数,调整细胞密度至1×105个/ml。(2)接种细胞：将Transwell小室放入24孔板中,下室加入含10%FBS的DMEM培养液500μl；取细胞悬液100μl加入上室,细胞数为1×105个/孔,并按照实验组设计在上室加入药物至终浓度组为0、20、40、80μmol/L,。(时间组以药物浓度40μmol/L的Cur分别作用0、6、12、24h,每个样本设置3次重复。(3)培养细胞：37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24h。(4)固定及染色：取出Transwell小室,PBS轻轻冲洗,上下各冲洗1次；用棉签擦去微孔膜上层的细胞；甲醇室温下固定15min,苏木素染液染色40 min,蒸馏水冲洗。(5)镜检：在倒置显微镜下(200×)对迁移至微孔膜下层的细胞计数。每个样本选取5个视野计数细胞个数,取均数。4、Western Blot检测Cur作用后T3细胞系相关蛋白表达提取T3细胞蛋白质,测定蛋白浓度；蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳；免疫印迹法；蛋白印迹的分析。5、检测分别加入,PI3K特异性抑制剂LY294002和姜黄素以及二者共同做用后T3细胞系中p-Akt蛋白的表达Western blot检测在引入PI3K特异性抑制剂LY294002(终浓度为20μmol/L)后,分别比较了空白组,Cur组(终浓度为20μmol/L), LY294002组,以及Cur和LY294002联合作用组作用后,p-Akt蛋白的表达水平。实验结果一、T3细胞系的培养和鉴定倒置显微镜下观察T3细胞系的形态：正常状态下,T3肿瘤细胞系约6小时贴壁,培育24小时后,癌细胞铺满培养瓶底,形态为椭圆形,菱形等呈巢团状排列,弥漫性分布,生长旺盛。Western Blot检测结果显示Akt, K-ras正常表达而p53蛋白的表达缺失,证实T3转基因细胞系在传代培养后,基因特征表达稳定。二、姜黄素对T3细胞系增殖的影响以不同浓度梯度的Cur作用于T3细胞系,当浓度为20μmol/L时,其对细胞的增殖抑制率为43.17%,已接近50%,其增殖抑制率明显高于对照组,有统计学意义(P＜0.05)；当浓度为40μmol/L时,其增殖抑制率达到87.61%(P<0.D1)；在0-48小时期间,随着时间的延长, Cur对T3细胞系增殖抑制率逐渐增强,并具有时间依赖性。三、姜黄素对T3细胞系迁移能力的影响不同浓度梯度的Cur可对T3细胞系的迁移能力产生影响。随着药物浓度的增加,细胞迁移数明显减少,细胞迁移能力有所下降,在药物浓度为20μmol/L时,细胞迁移抑制率为51.54%,药物浓度为40μmol/L和80μmol/L时,细胞迁移抑制率分别达到75.11%和80.38%,同时细胞出现变圆、状态变差的情况。在40μmol/L药物浓度,作用时间24h细胞迁移能力明显下降(P＜0.05),随着时间延长,细胞迁移能力逐渐减弱。四、姜黄素作用下T3细胞系中Akt、K-ras、p-Akt、PI3K蛋白表达的变化本研究应用Western blot检测培养0、6、12、24小时,在浓度为20μmol/L的Cur作用下,T3肿瘤细胞系中Akt及其活化形式磷酸化Akt (p-Akt)、K-ras、PI3K蛋白的表达水平。检测结果表明,p-Akt表达水平,具有时间依赖效应,其在0小时表达最强,12小时表达明显减弱,24小时表达基本消失,光密度值相对比值进行比对分析有统计学意义(P<0.05)。Akt在各时间组中的表达水平没有显著变化(P>0.05)。K-ras的表达水平随着时间的延长而逐渐减弱；而各时间组的表达差异不具有统计学意义(P>0.05)。P13K的表达水平0小时表达最强,6小时稍弱,并随着培养时间的延长,表达逐渐减弱。五、分别加入PI3K特异性抑制剂LY294002和姜黄素以及二者共同作用后T3细胞系中p-Akt蛋白的表达Western blot检测在引入PI3K特异性抑制剂LY294002(终浓度为20μmol/L)后,分别比较了空白组, Cur组(终浓度为20μmol/L), LY294002组,以及Cur和LY294002联合作用组作用后,p-Akt蛋白的表达水平,结果表明,单独应用姜黄素或LY294002,都会对p-Akt蛋白的表达产生抑制作用,且姜黄素组的抑制水平高于LY294002组,而二者共同作用下,对p-Akt蛋白的表达的抑制更为明显,并有统计学意义(P<0.05)。结论1.Cur可以抑制T3细胞系增殖及迁移能力。2.Cur可通过降低p-Akt和K-ras蛋白表达从而抑制T3细胞系的增殖及迁移能力。3.Cur对T3细胞系中p-Akt蛋白表达的影响可能是经由PI3K/Akt信号转导通路得以实现的。