目的:我国口腔恶性肿瘤以癌为常见,其中舌鳞状细胞癌(简称舌鳞癌)构成比最高。近几年来,随着人们生活水平的提高,人类舌癌的发病率呈逐年上升趋势,而且发病年龄也逐渐呈低龄化。目前被人们所公认的治疗舌鳞癌最有效的方式,仍然以手术治疗、放射治疗和化学药物综合治疗为主。由于目前对舌鳞癌的发病机制、预后因素尚不十分清楚,加上舌体组织具有丰富的淋巴循环和血液循环,以及口腔颌面部复杂的解剖结构,舌鳞癌常早期发生颈部淋巴结转移,从而增加了治疗难度。文献报道舌癌患者术后5年生存率徘徊在50%左右,而复发患者1年生存率更是下降到60%(Ⅱ期)和32%(Ⅳ期)。目前认为影响舌鳞癌预后的因素主要有年龄、性别、组织分化程度、浸润深度、TNM分级、治疗方法、局部区域复发、淋巴结微转移等。但研究表明上述临床因素无法全面诠释舌鳞癌的生物学行为,尚需从分子水平进一步探讨影响舌癌发展预后的机理。因此充分研究舌鳞癌的生长转移机制,寻找与其诊断、治疗及预后相关的分子标志物对于舌鳞癌的治疗具有重要的临床意义。本课题采用免疫组化方法检测HuR、COX-2、VEGF-C三者在舌鳞癌组织及癌旁正常组织中的表达水平,分析三者之间的相关性及三者与临床病理特征、术后生存的关系,进一步通过转录组测序技术检测HuR不同表达水平的舌鳞癌患者鳞癌组织及癌旁正常组织的转录组,两两比较HuR高表达与低表达患者的舌鳞癌组织和癌旁正常组织的差异表达基因及转录本结构变异,通过分子水平上的验证,明确HuR高表达患者中发生特异改变的基因,进一步对因HuR参与而发生特异改变的基因进行功能注释和生物反应通路分析,为寻找舌癌与HuR相关的早期诊断、预后判断和治疗的新靶点提供理论依据。方法:(1)应用免疫组织化学染色(S-P法)检测83例舌鳞癌组织和癌旁正常组织中HuR、COX-2、VEGF-C的表达,应用卡方检验、Spearman等级相关分析等统计学方法分析三者之间的相关性及三者与舌鳞癌的临床病理特征的关系。(2)采用Kaplan-Meier法和Cox比例风险回归模型,分析HuR、COX-2、VEGF-C的在舌癌组织的表达与术后生存、无疾病进展生存期的关系,初步探讨HuR对于舌癌预后的价值。(3)收集2016年10月至2017年04月济宁医学院附属医院及济宁市第一人民院经病理证实的舌鳞癌手术切除的新鲜肿瘤组织及距离肿瘤边缘1cm以上的癌旁组织标本各17例。经修片、切片、HE染色后由两位病理学专家对所有肿瘤标本进行双盲评价,确定组织类型为舌鳞癌以及组织中的肿瘤细胞不小于70%,从中筛选出HuR表达强和弱的患者标本各3例。(4)采用Trizol法提取舌鳞癌患者肿瘤组织及癌旁组织的总RNA,筛选出Agilent 2100 analyzer质控分析RIN达到7.0以上,基本无降解、完整性较好的RNA。(5)Illumina(HiSeq 2500/4000)测序:由华大基因科技有限公司完成。(6)数据分析:1)使用过滤软件SOAPnuke对测序所得的原始数据(raw reads)进行过滤,将低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads过滤,得到clean reads;2)应用HISAT软件将clean reads比对到参考基因组上;3)新转录本预测、SNP&INDEL检测和差异剪接基因检测;4)对多个样品根据需求检测不同样品之间的差异表达基因,并对差异表达基因做深入的聚类分析和功能富集分析。结果:(1)83例舌鳞癌组织中,HuR胞浆阳性表达率、HuR胞核阳性表达率、胞浆COX-2阳性表达率及胞核VEGF-C高表达率分别为67.47%(56/83)、74.70%(62/83)、67.47%(56/83)及62.65%(52/83),与癌旁正常组织的0%、13.3%(11/83)和45.78%(38/83)、10.84%(9/83)相比较,差异均有显著的统计学意义。进一步统计学分析提示胞浆HuR、COX-2的阳性表达及胞核VEGF-C的高表达均与舌鳞癌患者的淋巴结转移及术后病理分期均有显著的相关性(P<0.05),而且胞核VEGF-C的高表达与舌鳞瘤分化程度也有密切相关性(P<0.05)。但胞核HuR的表达与舌鳞癌患者的临床病理特征(年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化、淋巴结转移、术后病理分期)均无相关性。(2)舌鳞癌中胞浆HuR、COX-2、VEGF-C的表达水平间存在明显的等级正相关性(P<0.05)。(3)胞浆HuR、COX-2的阳性表达组及VEGF-C高表达组的5年生存率及无疾病生存期均明显低于对照组(P<0.05);满足胞浆HuR、COX-2阳性及VEGF-C高表达的患者5年生存率及无疾病生存期均明显低于胞浆HuR、COX-2阴性及VEGF-C低表达的患者(P<0.05)。(4)Cox回归模型的多变量分析结果显示,舌鳞癌患者预后的独立危险因素包括胞浆HuR表达、术后病理分期以及有无淋巴结的转移(P<0.05),其中舌癌患者胞浆HuR阳性表达组的死亡风险是阴性表达组的6.7倍,淋巴结转移患者的死亡风险是没有淋巴结转移患者的3.2倍。(5)转录组测序质检:结果显示Q30均高于85%,平均每个样品的比对率达到88.70%,同时样品间均匀的比对率表明样品之间的数据具有可比性。(6)新转录本预测:使用StringTie对每个样品进行转录本重构,然后使用Cuffcompare将重构的转录本与参考注释信息比较得到新转录本,并用CPC软件对新转录本进行编码潜力的预测。最终,一共检测到44876个新转录本,其中预测编码的转录本为35421个,非编码转录本为9455个。(7)SNP和INDEL检测:10个舌鳞癌标本发现了大量的SNP,这些SNP分布在不同的区域;以A-G变异、C-T变异的SNP的数目最多,SNP及INDEL位点在外显子、内含子的分布约占总数的90%,而在基因的间隔区分布不超过10%。(8)差异剪接基因检测:在各标本中,可变剪接数目由多到少的类型分别为SE、RI、A3SS、A5SS、MXE,其中SE所占比例最大。比较HuR高表达的肿瘤组织与癌旁组织,相应的DSG的Gene Ontology功能以在生物学过程中所占比例最多,其次为细胞组分、分子功能,在其他样本及样本组中也可看到同样的比例趋势。(9)差异表达基因检测:单个样本的肿瘤组织与癌旁组织之间的差异表达基因数目较多,其中Hu R高表达的三组样本中分别有6426(52.72%)、6805(71.71%)、2739(57.55%)种基因表达上调,均超过表达下调基因比例;而HuR低表达的两组样本中分别有2360(48.30%)、6004(50.51%)种基因表达上调,与下调基因比例基本持平。(10)差异表达基因GO功能分析:在162条参与生物过程的两组的差异表达基因中,分别有16、16、13、13条参与细胞转化、单有机体过程、生物调节、代谢过程;在113条参与细胞组分的差异表达基因中,分别有16、16、12、12条参与细胞、细胞部分、细胞膜、细胞器;在38条参与分子功能的差异表达基因中,分别有17、10、3、3条参与螺旋、催化活性、信号转导活性、转运活性。GO功能对应的差异表达基因以下调基因为多见。(11)差异表达基因Pathway功能分析:根据差异基因检测结果进行KEGG生物通路分类以及富集分析,在34463条总的差异表达基因中,共有26条基因参与了Lo_Tu组和Hi_Tu组的差异表达,这些差异表达基因参与了信号转导通路、有机磷酸及磷酸代谢等途径。Lo_Tu组和Hi_Tu组的差异表达基因参与的细胞过程中主要有细胞代谢和死亡、细胞运输和代谢等。富集通路差异基因仍以下调基因为多。结论:(1)HuR、COX-2、VEGF-C在舌鳞癌组织中均呈高表达,HuR蛋白表达与舌鳞癌TNM分期、淋巴结转移均呈显著性相关。(2)胞浆HuR表达与COX-2、VEGF-C的表达均呈显著正相关,且三者两两之间的表达存在着等级相关性。(3)胞浆HuR而不是胞核HuR表达是舌鳞癌患者独立的预后因素,胞浆HuR表达可作为舌鳞癌患者预后的指标。(4)HuR有可能成为舌癌预后及分子治疗途径的潜在靶点。(5)HuR高表达可导致患者细胞基因表达发生改变,与癌旁组织及HuR低表达患者肿瘤组织比较,在肿瘤相关基因中,下调基因多于上调基因。对差异基因的GO富集分析和KEGG分析显示这些基因可参与特定的功能和信号传导途径,提示在舌癌发生发展中HuR可能具有独特的致病作用。(6)HuR高表达患者表达的多个基因包括参与细胞凋亡、信号传导通路、细胞免疫等的基因。(7)转录组高通量测序能够分析鉴定Hu R不同表达水平患者中的差异表达基因,为进一步研究HuR在舌癌的发生发展机制提供实验基础和理论依据。