猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是目前全球养猪业最大的威胁之一,猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)是猪流行性腹泻的致病因子。各龄段猪均可感染该病毒,临床症状主要表现为呕吐、小肠黄肿、水性腹泻等。哺乳期仔猪受PEDV的威胁最大,一旦感染死亡率高达90%以上。自20世纪70年代首次发现以来,PED已对我国乃至全球养猪业造成了巨大的经济损失,然而目前市面上PEDV疫苗效果并不能有效预防猪流行性腹泻(PED)疫情的发生,故研究安全有效的新型PEDV疫苗十分紧迫。已有研究表明利用杆状病毒表面展示系统展示病毒的抗原特征性蛋白,并以该重组杆状病毒作为疫苗类似物可以有效地刺激动物机体产生特异性免疫反应,但是仍然面临杆状病毒滴度低,纯化复杂等诸多问题。本研究拟通过构建生物素化重组杆状病毒来展示PEDV的主要抗原特征性蛋白S1。在杆状病毒表面高丰度展示S1的同时,利用生物素-链霉亲和素系统的高亲和力结合的特点,可简单高效地纯化杆状病毒。进而,以该病毒作为疫苗免疫怀孕大鼠,通过检测大鼠产生的S1特异性IgG和乳汁sIgA评价其免疫活性。本研究分别克隆了经修饰的PEDV S1基因、生物素连接酶基因(BrA)以及融合生物素受体肽序列(BAP)的杆状病毒基因gp64,利用Bac-to-Bac系统和线性化同源重组以及非同源末端连接构建重组杆状病毒。经Western blot、直接荧光、间接免疫荧光、免疫电镜分析S1蛋白在细胞中或病毒表面的表达和定位。利用链霉亲和素磁珠纯化生物素化重组杆状病毒,通过Western blot、银染以及荧光定量PCR分析重组病毒的纯化效果。分别用磁珠法纯化的重组杆状病毒以及野生型PEDV和杆状病毒Ac-WT、生理盐水(Saline)作为免疫原皮下免疫怀孕SD大鼠,通过ELISA方法检测孕鼠血清中S1特异性IgG,乳汁S1特异性sIgA以及大鼠乳汁总sIgA的含量分析重组杆状病毒的免疫原性。结果表明,生物素化重组杆状病毒可以高效表达PEDV S1蛋白并且可以将其展示在细胞和病毒表面。经磁珠纯化后,重组杆状病毒可通过银染分辨出杆状病毒的特征蛋白,说明显著提高了病毒纯度。并且,利用荧光定量PCR技术从病毒拷贝数方面进一步论证了纯化效果。ELISA分析表明,磁珠纯化后重组病毒可以显著刺激哺乳期大鼠在血清和乳汁中分别产生高水平的PEDV S1特异性IgG 和 sIgA。本研究最终制备的重组S1杆状病毒能够有效刺激哺乳期大鼠的免疫应答,并显著提高其乳汁中PEDV S1特异性sIgA的水平,为该类疫苗进一步的实际运用奠定了实验基础。