黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮光学适配体检测方法研究

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黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)具有强烈的致癌、致畸、致突变性和免疫损伤等,可通过污染农产品、食品和饲料或者间接污染动物产品(乳、肉、蛋)等方式进入食物链,严重影响到食品安全进而对人类健康造成威胁。因此,提高对食品中AFB1和ZEA污染水平及含量的监管,建立准确有效检测AFB1和ZEA的方法对于人类健康意义重大。本课题将比色和蚀刻方法可视化的特点以及荧光方法操作简单和信号响应快等优点与特异性强的核酸适配体(Apt)相结合,借助纳米金颗粒(Au NPs)的类酶活性和荧光淬灭特性,以及金纳米棒(Au NRs)的蚀刻效应,制备了三种用于真菌毒素AFB1以及ZEA检测的适配体光学传感器。具体研究内容如下:1.利用金纳米颗粒(Gold nanoparticles,Au NPs,Au)的类葡萄糖氧化酶活性作为催化葡萄糖(Glu)产生过氧化氢(H2O2)的材料,核酸适配体作为特异性识别元件,通过Apt和AFB1竞争结合Au NPs控制Au NPs的类酶催化活性,在显色剂ABTS的作用下展现出深浅不同的可视化效果用于AFB1的检测。研究表明,金属纳米材料的类酶活性较酶本身稳定性好、成本低廉。对实验参数进行优化,得到1/4 Au为最佳催化活性,0.2 M Glu为最佳浓度,催化Glu的反应时间为30 min,反应温度为室温,最佳p H为7,最佳有机溶剂体系是10%的甲醇,最佳反应时间为10min,最佳适配体浓度为0.1μM,在最佳条件下的得到AFB1的线性范围是1~70 ng/m L,检出(LOD)为0.8 ng/m L。对加标样品进行检测,得到加标回收率为88.1%~109.26%。2.为了提高可视化检测的灵敏度和响应速度,利用辣根过氧化物酶(HRP)蚀刻蓝绿色Au NRs,呈现出青、蓝、紫、粉、无、黄的丰富颜色变化,建立了基于核酸适配体结合金纳米棒蚀刻的AFB1多色传感器检测方法。经实验优化可知,当HRP浓度为0.02μg/m L,酶活反应时间为5 min,反应在室温下进行,Au NRs:CTAB最佳比例体积为1:4,适配体浓度为0.5μM时,在0.01~0.5 ng/m L范围内AFB1浓度与紫外可见吸收光谱变化呈良好的线性相关,检出限(LOD)为0.008 ng/m L。该比色传感器对AFB1具有良好选择性。对实际样品进行加标检测,AFB1的回收率为81%-119%,相对标准偏差(RSD)均低于10%。3.为了进一步提高传感器信号的灵敏度和检测目标的多元化,羧基荧光素(FAM)标记的AFB1适配体(FAM/Apt)以及罗丹明(ROX)标记的ZEA适配体(ROX/Apt)作为荧光探针,构建了Au NPS-FAM/Apt-ROX/Apt双色荧光信号增大型适配体传感器,用于AFB1和ZEA的同时检测。优化后得到最佳工作条件:FAM-Apt-1和ROX-Apt-2为最佳适配体链;Apt与Au NPs的孵育时间为20min,反应体积为40μL;Apt与毒素的孵育时间为10 min,反应体积为50μL;PBS(p H=8.5)缓冲液为工作液,室温为工作环境,在以上最佳条件下建立标准曲线,得到AFB1的线性范围是0.01-50 ng/m L;ZEA的线性范围是0.01~200 ng/m L。AFB1和ZEA的检出限分别为8 pg/m L、6 pg/m L。该传感器对AFB1和ZEA检测具有较好的特异选择性。对实际样品进行加标检测,AFB1的回收率为81%~119%,ZEA的回收率为86%~104.6%。
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