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目的：分别构建及获取有效的CREB-1干扰与过表达质粒载体，为实验提供相关的干预材料及基础。方法：利用碱基互补配对原理，通过生物信息学软件及CREB-1基因mRNA序列，设计3条理论上能靶向抑制CREB-1表达的茎环状shRNA，分别命名为sh-CREB1-1、sh-CREB1-2与sh-CREB1-3。以pGenesil-1.1为载体，含增强绿色荧光蛋白（EGFP），通过基因工程技术合成含有上述shRNA的质粒，另合成针对内参GADPH的sh-GADPH与不针对任何基因的空白质粒sh-BLANK。CREB-1表达载体pRSV-CREB-1由MichaelE.Greenberg教授赠与，常规从纸片中提取及扩增，并行DNA测序以初步验证其序列。将以上6组质粒分别用脂质体法转染至HSC-T6，转染后12h、24h、36h、48h、60h、72h在荧光显微镜下观察GFP初步判断转染效果及效率，然后分别提取细胞总蛋白，WesternBlot检测CREB-1及内参GAPDH蛋白的表达变化。结果：pRSV-CREB-1表达载体经DNA测序后与GenBank中CREB-1碱基序列相比对，其编码CREB-1蛋白氨基酸的碱基一致率达93.4%，并且CREB-1磷酸化关键位点（S133）的氨基酸区域完全一致。含有EGFP的质粒组细胞从转染后24小时到72小时均能观察到绿色荧光，转染后48h荧光最强，其转染效率约为15%~20%。转染后48h，WesternBlot结果显示：与转染sh-BLANK的空白组相比，sh-CREB1-1组、sh-CREB1-2组、sh-CREB1-3组、pRSV-CREB-1组HSC中CREB-1蛋白表达分别为0.61±0.17（P<0.05）、0.55±0.07（P<0.01）、0.94±0.27（P>0.05）、1.60±0.11（P<0.05）；同时，与空白组相比，sh-GAPDH组的内参GAPDH表达明显下降0.20±0.08（P<0.01）。结论：成功构建及获取CREB-1干扰及过表达质粒载体sh-CREB1与pRSV-CREB-1。3条干扰载体中sh-CREB1-2的抑制效果最佳，可作为后续实验的首选干扰载体。sh-GAPDH组的结果进一步证实本转染体系有效可行。背景与目的：在大鼠肠上皮细胞中，存在CREB-1与TGF-β3反馈分泌环，即两者可相互促进对方的表达。前期研究显示外源性TGF-β3能够诱导HSC中CREB-1蛋白的表达及促进该蛋白的磷酸化，而HSC中CREB-1是否也存在促进TGF-β3的通路目前尚不明确，本部分实验为探讨CREB-1及其磷酸化状态对HSC中内源性TGF-β3分泌的影响。方法：利用上一部分工作所建立的转染体系及筛选的CREB-1干扰载体sh-CREB1-2、表达质粒pRSV-CREB1及空白质粒转染HSC，转染后46小时换不含血清的培养基液并加（+）或不加（-）入外源性TGF-β3处理，2小时后留取细胞外液及提取细胞胞浆和胞核蛋白，WesternBlot法检测HSC胞浆蛋白中CREB-1及胞核蛋白中磷酸化CREB-1（p-CREB-1）蛋白的表达，ELISA法检测细胞外液中内源性TGF-β3的分泌。另外，采用抑制CREB-1磷酸化试剂H89与促进CREB-1磷酸化试剂Forskolin（毛喉素）分别处理HSC细胞，检测处理后细胞核蛋白中p-CREB-1表达及细胞外液中TGF-β3的分泌。结果：与空白转染BLANK（-）组相比，sh-CREB1-2（-）组胞浆蛋白中的CREB-1及胞核蛋白中的p-CREB-1表达降低，分别为0.63±0.11（P<0.05）与0.93±0.10（P>0.05），细胞外TGF-β3分泌减少为0.81±0.18（P>0.05）；pRSV-C（-）组中CREB-1及p-CREB-1蛋白表达上升为1.66±0.14（P<0.05）与1.23±0.14（P>0.05），细胞外TGF-β3分泌为1.13±0.07（P>0.05）。与BLANK（+）组相比，sh-CREB1-2（+）组胞浆蛋白中的CREB-1及胞核蛋白中的p-CREB-1表达亦降低，分别为0.45±0.08（P<0.05）与0.32±0.08（P<0.05），细胞外TGF-β3分泌减少为0.35±0.05（P<0.05）；pRSV-C（+）组胞浆蛋白中的CREB-1及胞核蛋白中的p-CREB-1表达升高，分别为2.19±0.08（P<0.05）与2.75±0.14（P<0.05），细胞外TGF-β3分泌增多为2.56±0.19（P<0.05）。与空白对照（Control）组相比，H89组p-CREB-1蛋白表达降低为0.53±0.07（P<0.05），细胞外TGF-β3分泌减少为0.44±0.05（P<0.05）；Forskolin组p-CREB-1蛋白表达升高为2.13±0.09（P<0.05），细胞外TGF-β3分泌增多达3.76±0.11（P<0.05）。结论：增加HSC中CREB-1蛋白的表达及其磷酸化，可以增加HSC中内源性TGF-β3的分泌；反之，减少HSC中CREB-1蛋白的表达及其磷酸化，则降低HSC中内源性TGF-β3的分泌。提示p-CREB-1是介导HSC内源性TGF-β3分泌的关键因子，为完善TGF-β3抑制肝纤维化机制提供了新的实验依据。