EB病毒感染非常普遍，与其相关的疾病(主要侵犯机体的造血系统和淋巴系统)很多，据统计90％的人群中感染了EB病毒。其中包括多种恶性肿瘤，严重危害人类健康。 经过多年的病理学研究发现，几乎100％的鼻咽癌肿瘤，90％非洲来源的Burkitts淋巴瘤，40％-60％的何杰金氏病和非何杰金氏病含有EB病毒基因组。以华南地区高发性肿瘤——鼻咽癌为例，在鼻咽癌的三种类型中未分化型鼻咽癌的发生，发展与EBV的关系是十分肯定的。这种鼻咽癌病毒相关肿瘤细胞内存在EBV的特征为鼻咽癌病毒相关肿瘤的基因治疗提供了靶点。EB病毒基因组含有TK(胸苷激酶)基因，是一种自杀基因，是EBV裂解感染期表达的蛋白，TK能磷酸化GCV(丙氧鸟苷)，磷酸化后的丙氧鸟苷能抑制病毒DNA合成酶的活性，从而阻止肿瘤细胞DNA合成，选择性地杀伤快速增殖的肿瘤细胞从而引起细胞死亡。而TK基因往往在这些肿瘤细胞中处于沉默状态，解除EB病毒TK基因沉默，激活EB病毒的自杀基因TK(胸腺嘧啶激酶)，成为一种日益受关注的治疗方式。国外有不少的报道，各种诱导TK基因激活的诱导剂联合GCV(丙氧鸟苷)进行治疗，能引相关EB病毒阳性肿瘤细胞的死亡，其关键环节都是解除了TK基因的沉默。解除TK基因沉默的机制在不同的EB病毒相关肿瘤细胞中不太一致，因此，进一步了解在EB病毒相关肿瘤细胞中解除TK基因沉默的机制，为临床应用此种方式的基因治疗提供一定的理论依据。 目的： 本研究通过丁酸钠解除B95-8细胞中EBV-TK基因的沉默，增加TK基因表达的作用，联合丁酸钠和丙氧鸟苷杀伤细胞的作用的变化，及通过阻断或激活相应的可能的信号传导通路，探讨解除EBV-TK基因沉默的机制，为这种基因疗法在临床应用奠定基础。 方法： 1．通过NaB与B95-8细胞共培育，引起EBV进入裂解期感染并且表达裂解期蛋白TK 不同浓度的NaB与B95-8细胞共同孵育36h后，检测细胞的EB病毒是否进入裂解期，并且表达裂解期蛋白TK，用Western blot检测TK蛋白的表达变化。 2． GCV对B95-8细胞的生长抑制作用联合应用NaB和GCV对B95-8细胞的生长抑制作用通过培养B95-8细胞，联合应用NaB和GCV共同孵育细胞，B95-8细胞首先与NaB共孵育诱导24小时，让TK表达，再与GCV共孵育，连续培养6天。设置对照组，观察其效应，是否有加强抑制细胞生长的效应，使用MTT检测细胞存活率。 4．探讨解除B95-8细胞EBVoTK基因沉默的机制往B95-8细胞分别转染质粒pCMV-MEKKl、pCMV-RafS621A、pCMV-RasN17、Aktl-dn，12小时后与浓度为2mmol的NaB共培养，诱导24小时后，再与浓度为100ug/mlGCV，连续培养3天或6天。设置对照组。3天或6天后MTT检测细胞存活率的改变。另外，B95-8细胞转染质粒48小时后，Western blot检测TK蛋白表达情况，设计阴性和阳性对照组。 结果： 1． NaB对B95-8细胞EBV-TK的激活作用呈一定的浓度依赖性，在NaB浓度为2mmol/L时能诱导B95-8细胞EBV进入裂解期，激活EBV-TK的表达。通过NaB对B95-8细胞诱导培养36小时，Western blot检测到可见的TK表达增高。 2． B95-8细胞与不同浓度的GCV进行共孵育，单独的GCV对B95-8细胞的杀伤作用不理想。GCV对B95-8细胞的杀伤作用呈一定的浓度依赖性，低浓度对B95-8细胞的杀伤作用并不明显，当达到100μg/ml时，对B95-8细胞的杀伤作用才开始显现。B95-8细胞与不同浓度的GCV共培育6天后，MTT检测结果显示，当GCV浓度为100μg/ml时对细胞生长抑制为27.3％、200μg/ml为29.0％、400μg/ml为38.3％。 3．联合应用NaB和GCV与B95-8细胞共孵育，对B95-8细胞的杀伤效应明显增强。通过B95-8细胞和浓度为2mmol的NaB先共孵育再和浓度为100μg/mlGCV共培养6天后，对细胞生长抑制率可达53.1％。 4．我们用不同的信号传导通路上的质粒转染B95-8细胞，三个阻断型质粒，分别为：pCMV-RafS621A、pCMV-RasN17和Aktl/dn，一个激活型质粒pCMV-MEKKl。转染质粒pCMV-RafS621A、pCMV-RasN17后，未能减弱NaB加强B95-8细胞对GCV的敏感性的作用。转染质粒Aktl/dn后，加强了NaB和GCV对B95-8细胞杀伤效应的结果，并且能加强GCV对B95-8细胞的杀伤效应。转染质粒pCMV-MEKKl后，加强了GCV对B95-8细胞的生长抑制作用。 5．以质粒pCMV-MEKKl转染B95-8细胞后，Westem blot检测到TK蛋白水平明显高于对照，提示活化型MEKKl可激活EBV-TK基因表达。 结论： 本研究通过B95-8细胞与不同浓度的GCV进行共培养，证实单独抗肿瘤药物GCV对B95-8细胞的杀伤作用并不理想；NaB通过诱导B95-8细胞EBVoTK基因激活，解除基因沉默，使TK蛋白表达，当与GCV联合应用时，能有效杀伤B95-8细胞。在阻断Akt信号传导通路的实验中，由于内源性Akt活性受到抑制，从而加强了NaB与GCV联合杀伤B95-8细胞的效应。我们研究证实，MEKK1可诱导B95-8细胞产生解除EBV-TK基因沉默的应答，进而强化了GCV杀伤B95-8细胞的效应。以上研究初步探讨了解除EBV-TK基因沉默的机制，为以EBV为靶的基因治疗鼻咽癌病毒相关肿瘤的方法提供一定的实验依据。