背景及目的:带状疱疹后神经痛(Postherpetic neuralgia,PHN)是一种令患者绝望的疾病,是罹患带状疱疹(Herpes zoster,HZ)后最常见的并发症,被普遍认为是一种神经病理性痛的综合症[1,30]。在北美、欧洲及亚非地区,每年每千人中就有4至4.5个新增的HZ病例[5]。在如此庞大基数的HZ患者中,10%至20%将发展成为PHN患者[30]。其临床症状主要是在之前疱疹所波及的皮节区范围内发生的自发性疼痛、痛觉过敏和感觉迟钝等,大多数人的症状会持续3个月至1年,更有甚者可持续数年。PHN患者的生活质量及工作受到严重的影响,症状较重者常导致抑郁甚或自杀倾向,为家庭和社会增添了沉重的经济、精神负担[25,30,35]。目前主要是通过药物进行对症治疗,但各类药物均无法长期有效的改善症状,并且不可避免的带来了药物副作用[4,5,25,35,47,59]。因此,要研发出更有效的治疗手段及药物,我们首先要搞清楚PHN的确切病因及其背后的发病机制。PHN的主要发病原因可能是潜伏于患者颅神经节、背根神经节以及整个神经轴上的自主神经节内的带状疱疹病毒再次激活而产生的相应复杂的级联反应所导致的[1,5,8,10]。有学者于1990年首次成功将带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)导入成年大鼠体内,且病毒能够长期潜伏感染于大鼠周围神经系统中。并由此成功构建了PHN模型大鼠,该模型逐渐成熟并大为推广[30,42,87]。然而,该模型的构建难度大,成功率低,常以失败结局,包括VZV培养条件苛刻,热痛阈异常状态诱导困难,局部组织炎症状态,局部皮损严重甚至是vzv扩散至中枢神经系统后导致的大鼠瘫痪等等[44,67,86]。也许正是因为模型构建难以达标,因此phn发病机制的研究进展才缓慢不前。学者hui-linpan等人于2003年意外发现树酯毒素(resiniferatoxin,rtx)作用于成年大鼠后能够使其产生机械痛阈及热痛阈的双相变化,这种痛阈的双相变化与phn患者的临床表现十分相似[68]。目前,越来越多的学者接受这种动物模型,认为该模型稳定、易获取并且更贴切的模仿了phn病人的临床表现,从症状学角度可以认为其是一种稳定的非病毒诱导的phn模型,是探索神经病理性痛发病机制的有力模型[44,67-70]。trpv1受体是一种非选择性钠/钙离子通道,首次被caterinaetal.克隆并被描述为“温热感受器及热伤害传感器”,主要表达在伤害性传入神经纤维(c类纤维)上。而rtx是辣椒素(capsaicin)的超能类似物,可激活辣椒素受体(trpv1)[62-64]。因此,我们认为trpv1可能参与调节rtx致痛模型大鼠痛阈的变化。另外,大量研究证实,mapk家族在神经病理性痛的诱导和维持方面具有不可忽视的重要性。神经病理性痛模型如脊神经结扎模型及坐骨神经结扎模型中,pjnk于脊髓背角的星型细胞内呈现特定时间点的高表达状态[76]。我们推断jnk可能亦参与调节rtx致痛模型大鼠痛阈的变化。综上,我们认为脊髓trpv1及jnk可能参与调节phn痛阈变化的过程。通过本实验我们可以进一步印证rtx致痛模型是一种可靠的、稳定的phn模型。再者,对于了解phn发病机制及治疗策略可能提供新的理论依据。方法:本实验首先通过在成年sd(sprague-dawley)大鼠腹腔内注射rtx建立phn模型大鼠。通过多时间点的行为学检测方法,以明确模型大鼠的机械痛阈及热痛阈的变化规律,进而对本疼痛模型的构建成功与否进行评估,以确定phn大鼠模型的成功建立及稳定维持;分别依据热痛阈及机械痛阈的时间变化特点,选择合适的时间点通过westernblot测定脊髓trpv1和jnk的表达水平。此后分别根据热痛阈及机械痛阈的变化规律,选择适宜的时间点分别进行鞘内注射trpv1或jnk的敏感抑制剂,之后再次通过行为学检测方法观察相应抑制剂作用后模型大鼠的热痛阈及机械痛阈的变化规律、同时通过westernblot测定脊髓trpv1和jnk的表达水平是否在特定的时间点经鞘内给药后发生变化。结果:实验一:rtx致痛模型大鼠的构建及评价(1)将rtx溶解于新鲜配制的10%吐温80、10%乙醇和80%的生理盐水混合液中,制成后浓度为40ug/ml。按200ug/kg浓度的rtx进行腹腔注射构建大鼠phn模型。在rtx处理前2d,处理后5周内每隔3d进行痛行为学检测,发现rtx处理1d后,大鼠出现明显的热痛阈(thermalwithdrawallatency,twl)升高,2d后twl升高到最大值(26.0±1.2s),持续大于5周。而sham组的twl无明显变化(p<0.05)。rtx处理10d后,大鼠有明显的机械痛阈(pawwithdrawalthreshold,pwt)降低,2周时pwt降低至最小值(5.2±1.3g),持续超过5周。而sham组的pwt无明显变化(p<0.05)。这提示从行为学角度来说rtx构建的phn模型已基本成功。(2)依据模型大鼠twl及pwt的变化特点,选择合适时间点在冰上快速取出大鼠脊髓腰膨大段,完善处理后,通过westernblot测定脊髓trpv1和jnk的表达。发现与sham组相比,rtx处理后1d脊髓背角trpv1表达减少,2d达最低值,并持续5周左右(p<0.05)。与sham组相比,rtx处理后10d脊髓背角p-jnk表达升高,2周达最大值,并持续5周左右(p<0.05)。综上可知trpv1与pjnk在大鼠脊髓背角的表达变化分别与twl及pwt的变化规律在时间窗上基本一致。实验二:鞘内分别注射trpv1与pjnk的抑制剂可影响模型大鼠痛阈的改变及脊髓trpv1与pjnk的表达变化(1)选择适宜时间点:由实验一可发现模型大鼠的twl在2d时升高至最大值,同时发现脊髓背角的trpv1是在2d时表达量最低。同理,发现2周时模型大鼠的pwt降至最低值且jnk的表达量最高。这基本表明rtx处理后2d时模型大鼠的热触觉迟钝(热痛阈升高)已稳定形成,2周时机械痛敏(机械痛阈降低)已稳定形成。(2)在rtx处理前0.5h和处理后2d时分别经鞘内注射trpv1的敏感抑制剂capsazepine(50nmol),发现预先(rtx处理前0.5h)鞘内给予capsazepine(50nmol)后可明显改善rtx诱发的热触觉迟钝(热痛阈升高),twl降低明显(p<0.05)。然而,当rtx诱发的热痛阈升高持续存在时(2d)再给予上述capsazepine(50nmol)鞘内治疗,则不能有效改善热痛阈升高。同理,在rtx处理前0.5h和处理后2周时分别经鞘内注射jnk的敏感抑制剂sp600125(50nmol),发现在rtx诱导的机械痛敏(机械痛阈降低)持续存在时(2周)鞘内给予sp600125(50nmol)后2~6h内可明显改善rtx诱发的机械痛敏(机械痛阈降低),pwt明显升高(p<0.05)。然而,预先(rtx处理前0.5h)鞘内给予sp600125(50nmol),则不能有效缓解机械痛敏(fig.3b)。这从行为学角度说明,trpv1可能参与rtx模型的热痛阈升高的发生阶段,而非维持阶段;jnk可能参与rtx模型的机械痛阈降低的维持阶段,而非发生阶段。(3)根据上述trpv1及jnk抑制剂鞘内注射的时间点,分别选取合适的时间点在冰上快速取出大鼠腰膨大段脊髓,完善处理后,通过westernblot测定脊髓trpv1和jnk的表达。观察到预先(rtx处理前0.5h)鞘内给予capsazepine(50nmol)后trpv1表达上调,然而rtx处理2d时鞘内给予上述capsazepine(50nmol)后trpv1表达无明显变化(p<0.05);发现rtx处理2周时鞘内给予sp600125(50nmol)后p-jnk表达下调,而预先(rtx处理前0.5h)鞘内给予上述sp600125(50nmol)后p-jnk表达无明显变化(fig.4d;p<0.05)。从脊髓蛋白角度,再次说明trpv1可能参与rtx模型的热痛阈升高的发生阶段,而非维持阶段;jnk可能参与rtx模型的机械痛阈降低的维持阶段,而非发生阶段。结论:本实验主要的创新之处在于验证了rtx致痛模型大鼠可以稳定的模仿临床phn病人的症状。进一步印证rtx致痛动物模型是一种可靠的、稳定的phn模型。同时通过合适的时间点经鞘内给予相应抑制剂,发现脊髓trpv1与jnk分别参与rtx致痛模型大鼠的痛阈改变,提示trpv1与jnk可能参与phn患者痛阈变化的调节。(1)rtx处理成年sd大鼠后,可在一定时间后分别可产生明确的热痛阈及机械痛阈的变化,并且这种双相的痛阈改变可在较长时间内维持稳定。rtx致痛模型能够准确的模仿phn病人的临床表现,可认为是一种可靠的、稳定的phn动物模型。从侧面反映本实验成功构建rtx诱导的非病毒phn模型,并为后续实验奠定了良好的基础。(2)rtx致痛模型大鼠脊髓trpv1与jnk的表达变化分别与热痛阈及机械痛阈的变化规律在时间窗上基本一致。提示脊髓trpv1与jnk可能参与phn病人痛阈变化的调节:trpv1参与调节热痛阈,jnk参与调节机械痛阈。(3)不同时间点经鞘内分别给予相应抑制剂后,从行为学层面和脊髓蛋白层面均发现RTX致痛模型大鼠脊髓TRPV1可能参与调节其热痛阈升高的发生阶段而非维持阶段;脊髓JNK可能参与调节其机械痛阈降低的维持阶段而非发生阶段。以上提示对于PHN患者发生热触觉迟钝(热痛阈升高)时,若能够在早期及时鞘内给予TRPV1抑制剂可能存在较好缓解效果;同理,PHN患者发生机械痛敏(机械痛阈降低)时,若能够在其维持期鞘内给予JNK抑制剂可能存在较好镇痛效果。