背景随着经济的发展和生活水平的提高,人们日常膳食中的油脂含量过多,且多以饱和脂肪酸、ω-6类脂肪酸为主。它们是一些炎症介质的原料,参与动脉粥样硬化、糖尿病和炎症发生等病理变化,并刺激细胞增殖诱发肿瘤形成。当今社会饮食条件,一般ω-6脂肪酸都过量而ω-3严重不足,随之而来的是,近几十年我国肥胖、心脑血管疾病、糖尿病和恶性肿瘤发病率急剧上升,其中仅结直肠癌(colorectal cancer,CRC)在2014年全球估计中新发病例数便接近137万,居恶性肿瘤发病率的第三位。值得注意的是,ω-3脂肪酸不仅与CRC的发生发展有关而且有研究发现它可以抑制结直肠肿瘤。要保持身体健康,理想的食用油ω-6/ω-3脂肪酸比例是5-8:1。但现实ω-3脂肪酸远远达不到标准,许多含ω-3脂肪酸的深海鱼油保健产品价格昂贵,且效果不佳,而临床结直肠癌有效治疗手段花费高昂,还存在一定的个体差异,患者承受着经济、身体、心理等多方面的压力。因此,我们希望能找到一种有效的功能性食品治疗结直肠癌。亚油酸(linoleic acid,LA)是一种常见的ω-6类脂肪酸,在食用油中含量丰富,有些油中含有30%,有些甚至能达到60%-70%。共轭亚油酸(Conjugated linoleicacid,CLA)是的LA的同分异构体,主要存在于反刍动物脂肪和牛奶产品中。其中c9t11-CLA约占90%,t10c12-CLA约占10%,其余同分异构体所占甚微。研究证明CLA有着多种功效,例如抗癌,抗炎症,减肥,抗动脉粥样硬化,治疗糖尿病等,其中研究发现c9t11-CLA是CLA抗癌功能的主要同分异构体。大量研究证明c9t11-CLA能够减少细胞增殖和诱导细胞凋亡从而抑制乳腺癌、前列腺癌和结肠癌等。来源于多种细菌、真菌的亚油酸异构酶(linoleicacid isomerase,LAI)能将LA转化为各种CLA。其中,乳酸菌(Lactobacillus)、梭菌(Clostridium)、丁酸弧菌(Butyrivibrio)和真菌(Eubacterium)等属的微生物含有c9t1 1-CLA异构酶。痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium)属的微生物具有t10c12-CLA亚油酸异构酶。乳酸菌是人类以及其他动物肠道内的革兰氏阳性菌,是一种益生菌,而且是人体肠道中的优势菌群。广泛应用于食品发酵、医药生产、保健药物以及饲料添加等工业。近年来,大量研究以转化乳酸乳球菌为载体表达目的多肽的崭新给药方式。本课题组也成功得获得了胃泌素调节激素(Oxyntomodulin)、胰高血糖素样肽-1(Glucagon Like peptide-1,GLP-1)分别用于小鼠肥胖和糖尿病的治疗,并取得了较好的疗效。因此,本实验选择乳酸菌作为重组质粒的表达宿主。本实验构建含有罗伊氏乳杆菌LAI基因的LZ-LAI载体,并转入乳酸乳球菌,通过口服重组乳酸菌治疗小鼠结直肠肿瘤。目的构建含有LAI的LZ-LAI载体,并转入食品级的乳酸乳球菌,口服该转化乳酸菌治疗小鼠原发性结直肠肿瘤,并分析其治疗作用。方法(1)质粒构建:以质粒pLAD-GFP和pLAD-LAI-Flag为模板进行PCR分别获得带有NCO Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点的目的基因GFP和LAI,并插入pLZ载体获得表达质粒载体pLZ-GFP和pLZ-LAI-Flag。(2)电击转化鉴定:电击转化法将上述表达载体转入无质粒乳酸乳球菌感受态,经溴甲酚紫的筛选,得到分别含有pLZ-GFP的乳酸乳球菌(LZ-GFP)以及pLZ-LAI-Flag的乳酸乳球菌(LZ-LAI)。革兰氏染色观察阳性克隆乳酸乳球菌的形态,检测阳性克隆菌16s rDNA鉴定菌种类型,提取阳性克隆质粒PCR鉴定目的基因。(3)条件选择:LZ-GFP在加有乳糖的EM液体培养基中培养至OD600达到0.6,用nsin诱导荧光显微镜下观察拍照,Western Blot检测LZ-GFP和LZ-LAI上清、菌体中目的蛋白的表达。分别用0,0.5,1,2,3,4,5ng/mL的nisin诱导LZ-GFP乳酸菌6h酶标仪检测荧光值选择最佳诱导浓度;再用最佳诱导浓度分别诱导0,3,6,9,12,24h酶标仪检测荧光值选择最佳诱导时间。(4)体外活力检测:LZ-GFP菌体(浓度为6X 109/mL)加至人工胃肠液,分别培养0.5,1h,CTC染色流式细胞仪检测活细胞比例。最佳诱导浓度nisin诱导LZ-LAI最佳诱导时间转化LA,提取菌体培养液中总脂肪酸,甲基化后气相色谱与质谱联用仪(GC-MS)检测分析其成分。计算LZ-LAI的转化效率。(5)体内活力检测:选择12只6周左右、18-20g雄性C57BL小鼠,其中9只随机分成空白对照组(NC),LZ-GFP组(LG),LZ-GFP+nisin组(LGN),每组各3只。禁食4d后NC组小鼠灌胃0.1mL LZ空载菌+nisin(浓度为6×109/mL),LG 组灌胃 0.1mL LZ-GFP 菌体(浓度为 6×109/mL),LGN 组灌胃0.1mL LZ-GFP和nisin菌体混合物(浓度为6×109/mL);剩余3只分成空白组(NC),LZ-LAI 组(LL)和 LZ-LAI+nisin 组(LLN),同样禁食 4d 后 NC组小鼠灌胃0.1mL LZ空载菌+nisin(浓度为6×109/mL),LG组灌胃0.1mL LZ-LAI菌体(浓度为6×109/mL),LGN组灌胃0.1mL LZ-LAI和nisin菌体混合物(浓度为6×109/mL)。经过最佳诱导时间后LZ-GFP和LZ-LAI不同处理小鼠各处死1只,取肠道内容物,Western blot鉴定蛋白表达;另各取一只用小鼠活体成像仪分析菌体位置分布;剩余小鼠处死取内容物,经CTC染色荧光显微镜下观察拍照。(6)动物实验:取6-8周左右,18-20g雌雄APCmin/+造模成功小鼠18只,随机分配成空白对照组(CZ组),LZ组(LZ组)和LZ-CLA组(CLA组),每组6只小鼠。CZ组小鼠灌胃O.1mL生理盐+nisin,LZ组灌胃0.1mL空载菌+nisin 菌体混合物(浓度为 6×109/mL),CLA 组灌胃 O.1mL LZ-LAI+nisin 菌体混合物(浓度为6X 109/mL)。每组每天灌胃一次,自由进水进食,食物为高脂饮食,每三天称一次体重。时时观察小鼠状态,如若状态极差,则选择及时处死。取外周血,ELISA检测血清中TNF-α,IL-2,IL-4,IL-6细胞因子水平。解剖小鼠,取其内脏并称重,提取脾脏淋巴细胞,分别用CD3+、CD4+、CD8+特异性抗体处理后流式细胞术检测淋巴细胞比例。取小鼠结直肠剪开,计数肿瘤数目,测量肿瘤直径大小。肿瘤组织进行组织学分析,免疫组化分析肿瘤β-cantenin,Ki-67表达,TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡情况;Real-time PCR检测肿瘤组织中COX-2,EGFR,P53,PPARγ表达变化。结果(1)构建质粒与重组乳酸菌:成功获得pLZ-GFP和pLZ-LAI质粒。并成功转入乳酸乳球菌分别得到LZ-GFP、LZ-LAI阳性单克隆乳酸菌。革兰氏染色、16s rDNA和质粒测序结果验证构建成功。(2)条件选择:LZ-GFP能够成功表达GFP且只有菌体表达GFP,LZ-LAI乳酸菌在上清和菌体中均表达LAI。nisin最佳诱导浓度、最佳诱导时间分别为3ng/mL 和 18h。(3)体外活力检测:经PBS处理0.5、1h后的LZ-GFP乳酸菌存活率分别为33.5%和32.9%;人工胃液为51.6%和99.8%;人工小肠液为28.2%和24.6%;人工结肠液为43.2%和25.0%;人工含10g/L氨的结肠液为35.0%和25.6%;人工含20g/L氨的结肠液为47.0%和39.5%。乳酸菌能够在人工胃肠液中存活。GC-MS检测LZ-LAI转化产物中含有c9,t11-CLA,且转化效率为42.59%。(4)体内活力检测:动物成像实验结果显示重组乳酸菌主要分布于小鼠结肠位置。小鼠肠道内容物Western blot结果显示,重组乳酸菌能够在小鼠肠道内表达目的蛋白。肠道内容物CTC染色结果说明重组乳酸菌能够在小鼠肠道内存活,并能正常表达目的蛋白。(5)动物实验:①小鼠各种脏器指数比较发现,Control组与LZ组,LZ和CLZ组之间无显著性差异,而Control组肝脏指数与CLA组之间存在极显著性差异,p<0.001。此外,我们还发现CLA组除了肺指数较高外其余的器官指数均较两组低,尤其是脾脏指数;②实验结果表明LZ-LAI乳酸菌能显著性减少小鼠结直肠肿瘤数,其中CLA组的肿瘤总数比另外两组显著减少,差异有统计学意义(p<0.001),尽管CLA和Control组和LZ组就肿瘤直径≤2mm和>2mm两组而言不存在显著性差异,但是CLA仍有缩小肿瘤直径的趋势,说明重组乳酸菌对结直肠肿瘤有较明显的效果。此外,LZ组也有减少肿瘤数和缩小肿瘤直径的趋势;③病理组织学分析结果表明CLA组对小鼠结直肠肿瘤具有良好的治疗作用,该组小鼠的生存曲线与对照组之间有极显著性差异,p<0.001,且重组LZ-LAI能够显著延长结直肠肿瘤小鼠的生存时间。另外,我们发现LZ组也能在一定程度上延长小鼠的生存期。免疫组化和TUNEL结果表明,CLA组不仅能够抑制小鼠肠道肿瘤组织细胞增殖,而且能够促进肿瘤组织细胞的凋亡。④流式细胞仪分析结果表明,CLA组的小鼠淋巴细胞的比例显著增加,CD4-CD8+T淋巴细胞的比例也增加。ELISA结果显示,Control组与LZ组相比TNF-α水平存在显著性差异(p<0.01),与CLA组存在差异极显著(p<0.001),LZ与CLA组之间也存在显著性差异(p<0.001)其他细胞因子在三组之间均无显著性差异。但是CLA组有增加IL-2分泌的趋势。Real-time PCR结果显示,与LZ组相比,CLA组显著抑制COX-2基因的表达;LZ组和CLA组均显著促进p53基因的表达,但两组之间无显著性差异;此外,CLA组显著抑制EGFR基因的表达,与Control组相比差异有统计学意义(p<0.05),虽然LZ组与Control组间无显著性差异,但是LZ仍有抑制EGFR基因表达的趋势;三组PPARγ基因表达无显著性差异,不过CLA组有抑制其表达的趋势。结论本实验成功构建了重组乳酸乳球菌LZ-GFP和LZ-LAI;LZ-GFP只在菌体表达GFP,而LZ-LAI可将LAI分泌至体外,nisin最佳诱导浓度为3ng/mL,最佳诱导时间为18h;重组乳酸菌能够在人工胃肠液中存活;LZ-LAI成功将LA转化为c9t11-CLA,转化效率为42.59%;重组乳酸菌主要分布于结直肠部分,且能够在小鼠肠道内存活并能成功表达目的蛋白;LZ-LAI乳酸菌显著延长小鼠的生存期,可以有效抑制结直肠肿瘤细胞增殖并促进其凋亡,还能显著提高小鼠机体免疫,增加淋巴细胞比例和细胞毒性T细胞的比例,此外,它还促进p53基因的表达,而抑制COX-2和EGFR的表达,有趣的是LZ空载体菌也表现出一定的抑制结直肠肿瘤的效果。本研究中乳酸乳球菌作为载体,在肠道内表达分泌的LAI将LA转化为c9t11-CLA,不仅降低机体ω-6脂肪酸比例,而且转化的CLA能够有效治疗结直肠肿瘤,开辟了一条治疗结直肠肿瘤的全新途径。