黑果枸杞LrSUS对枝刺发生的影响及其可能机理

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黑果枸杞(Lycium ruthenicum)为茄科枸杞属灌木,是兼具生态价值和经济价值的优良树种。本文通过对黑果枸杞蔗糖合酶基因(LrSUS)进行生信学分析以及RNA原位杂交,初步判断LrSUS与枝刺发生相关,通过对LrSUS超表及对照黑果枸杞的比较分析探索LrSUS促进黑果枸杞生长及促进枝刺发生的机理,并尝试通过转基因RNAi技术获得更加适应生产的无刺或少刺黑果枸杞,主要研究发现如下:(1)LrSUS含有10个内含子,11个外显子。LrSUS蛋白共有803个氨基酸组成,属于弱酸性蛋白,含有蔗糖合酶结构域和糖基转移酶结构域,并无跨膜结构域且主要定位在细胞质中。蛋白磷酸化修饰显示其含有丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸三种合计70个磷酸化位点,二级结构分析显示该蛋白主要由无规则卷曲和α螺旋组成,三级结构显示LrSUS蛋白由两个对称的四聚体构成。系统发育分析显示LrSUS属于SUSⅠ类,且与马铃薯和番茄相关基因亲缘较近。RNA荧光原位杂交显示LrSUS在有刺枝条的刺部位表达明显高于无刺枝条的刺原基,推测LrSUS促进黑果枸杞可见枝刺的发生和生长。(2)扩繁LrSUS超表达黑果枸杞并炼苗移栽。DNA及RNA鉴定显示移栽后外源基因未丢失且叶片和茎段中LrSUS表达量比未转基因对照高。蔗糖合酶活性测定发现超表达LrSUS植株茎和叶中蔗糖合酶活性均略高于未转基因对照植株。生长形态指标测定发现,超表达植株的出刺率、叶长、叶宽、枝粗及新生枝条数均显著高于对照植株。这证明LrSUS不但促进黑果枸杞生长抽茎,而且促进其可见枝刺的发生。(3)高通量转录组测序(RNA-Seq)分析显示LrSUS超表达和对照材料的叶和茎分别被聚为两个不同的大类;超表达和对照叶片之间的差异基因(DEG)为447个(LSUS vs.LWT),超表达和对照茎段之间的DEG为242个(SSUS vs.SWT)。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析证明RNA-Seq的结果可靠。超表达LrSUS和对照茎段DEG显著富集在ABC转运蛋白和氧化磷酸化等KEGG路径,并有8个DEG富集在淀粉蔗糖代谢KEGG通路。超表达LrSUS和对照叶片DEG显著富集在植物激素信号转导、植物-病原互作等KEGG路径,且有6个DEG被注释在淀粉蔗糖代谢KEGG通路。可见LrSUS通过影响上述KEGG代谢通路及其关键基因的表达来促进黑果枸杞生长、抽茎及产生可见枝刺。(4)设计并构建抑制LrSUS表达的pRNAi-SUS载体。基于课题组建立的黑果枸杞稳定遗传转化体系,延长预培养时间为4天。叶尖外植体经农杆菌EHA105或LBA4404工程菌(OD600=0.4)侵染5-15 min,可成功获得较多黑果枸杞转基因植株,平均稳定遗传转化率为9.3%。但是黑果枸杞转基因RNAi(LrSUS)植株在组培瓶内表现出植株矮小和根系生长缓慢的特点,这与LrSUS超表达黑果枸杞植株正好相反,也与前人的研究发现相一致。瓶内无法观测刺表型,因此目前不能判断是否获得无刺和少刺植株。本研究丰富了植物枝刺相关研究,揭示了黑果枸杞LrSUS基因的功能,并探索了LrSUS促进黑果枸杞生长、抽茎和枝刺发生的机理,为培育无刺黑果枸杞奠定基础。
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