前言 实验目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、培养、扩增及在体外单层培养条件下向软骨细胞分化的诱导条件及影响因素,建立一种最简化的成软骨细胞诱导体系,并用此体系诱导不同年龄大鼠的骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,对比其分化率有无差别,为临床上使用自体来源的间充质干细胞治疗中老年人关节软骨损伤提供参考。 实验方法 取不同年龄大鼠双侧股骨骨髓,1.073g/ml的Percoll液密度梯度离心得到MSCs,用含15%胎牛血清的低糖DMEM培养液悬浮细胞,置于37℃含5%CO₂的增湿培养箱中培养,4小时后首次换液,去除未贴壁细胞。以后每2～3天换液一次。约2周后传代。分别取4～6周龄和12月龄大鼠生长良好的第3代细胞绘制各自的生长曲线。然后用只含有TGF-β1一种生长因子的高糖型DMEM培养液分别诱导4～6周龄和12月龄大鼠第3代MSCs向软骨细胞分化,并用免疫组化和原位杂交等方法检测Ⅱ型胶原和Ⅱ型胶原mRNA的表达情况。最后分别计算4～6周龄和12月龄大鼠MSCs向软骨细胞分化的分化率,进行统计分析两者有无差异。 实验结果 1.原代培养的大鼠骨髓间充质干细胞一般2周左右可以长至80～90%融合。传代之后,细胞生长明显加快,一般5～7天即可长到80～90%