小檗碱(berberine,BBR)又名黄连素,是从我国传统中药黄连的根茎中提取出的主要有效成分。长期被临床用于治疗各类肠道感染性疾病,取得了良好的疗效。近年来的研究显示BBR还具有多种新的药理作用,如治疗糖尿病、降血脂等,适用范围较广,已成为传统中药药效成分研究的新热点。但目前在有关BBR研究中,对其作用的传统靶器官——肠道的应用研究却相对有限。最新的研究提示,BBR治疗肠道疾病仍有较大潜力,尚有许多药理作用有待挖掘。肠黏膜屏障主要由机械屏障、生物屏障、化学屏障及免疫屏障组成。机械屏障的结构基础是由肠上皮细胞与细胞间形成的完整连接。细胞间的连接方式有多种,包括紧密连接、粘附连接和缝隙连接,其中最主要的连接方式是紧密连接。肠上皮紧密连接的损伤参与了多种疾病的进展。因此,维持完整的肠上皮细胞紧密连接对保护肠屏障功能、防止细菌移位及毒性大分子进入人体有重要的意义。目前的研究显示,BBR具有抑菌、抗炎、抑制肠道腺体分泌和平滑肌收缩的作用,据此我们推测:BBR对肠上皮细胞紧密连接同样具有保护作用。在本研究论文中,我们利用不同紧密连接损伤模型,予以BBR处理,观察紧密连接功能、结构以及紧密连接蛋白分布的变化,旨在证实BBR对肠上皮紧密连接的保护作用,并阐明部分机制,为临床治疗肠道疾病提供新的治疗策略和理论依据。目的:利用Caco-2细胞建立肠上皮紧密连接的体外模型,并利用肿瘤坏死因子(TNF-α)和干扰素(IFN-γ)干预,造成肠上皮紧密连接的破坏。给予BBR处理,观察紧密连接结构、功能及紧密连接蛋白分布的变化,证实BBR对紧密连接的保护作用。方法:建立Caco-2细胞体外紧密连接模型后,利用不同浓度的BBR(25、50、100、200μM)处理72h,研究不同浓度的BBR对Caco-2细胞生长的影响。观察细胞生长状态、测定细胞跨膜电阻抗、LDH释放法测定细胞活力;确定有效浓度后,实验分为四组:对照组、BBR处理组、TNF-α+IFN-γ处理组、TNF-α+IFN-γ+BBR处理组。TNF-α+IFN-γ组用100U/ml IFN-γ处理19h后,加入10ng/ml TNF-α至72h;BBR处理组用有效浓度的BBR处理72h。用EVOM电压电阻仪测定细胞跨膜电阻抗、透射电镜观察紧密连接的超微结构、荧光分光光度计测量单层细胞通透性、Western blot测定紧密连接蛋白在紧密连接膜微区域中的分布、免疫荧光观察紧密连接蛋白分布。结果:体外实验表明,100μM以下的BBR能够呈剂量梯度的增加Caco-2单层细胞的跨膜电阻抗、降低单层细胞的通透性,且对细胞活力无明显影响;而200μM的BBR对Caco-2细胞则有显著的细胞毒作用。因此我们选择100μM作为BBR的有效剂量。分组实验表明,TNF-α联合IFN-γ处理使得Caco-2单层细胞的通透性增加、紧密连接的超微机构破坏。BBR能够一定程度的抑制促炎细胞因子的破坏作用,且这种保护作用可能是通过抑制紧密连接蛋白在胞膜及膜微区域分布的改变而起作用的。结论:一定剂量的BBR能够降低肠上皮紧密连接的通透性,这部分解释了BBR的抑制腹泻作用;BBR对体外促炎细胞因子造成的肠上皮紧密连接损伤具有保护作用,BBR单独或联合用药,对炎症性肠病等患者的肠黏膜屏障有一定的保护作用。目的:建立内毒素血症小鼠模型,观察内毒素血症状态下小鼠肠上皮紧密连接的破坏情况;采用BBR预处理和短期处理的方式进行干预,观察紧密连接结构和功能的变化,证实BBR对内毒素血症状态下肠上皮紧密连接的保护作用,并探讨其作用的机制。方法:雄性C57BL/6小鼠40只,6-8周,20-25g,随机分为对照组、BBR预处理组、内毒素血症组、BBR预处理+内毒素血症组、内毒素血症+BBR短期处理组共5组,每组8只。BBR预处理组采用BBR灌胃法,剂量为200mg/kg,每天灌胃一次连续灌胃7天;内毒素血症组采取腹腔注射LPS法,剂量为10 mg/kg;BBR短期处理组于腹腔注射LPS30min后,给予BBR 200mg/kg灌胃1次;对照组给予等量的生理盐水灌胃。腹腔注射LPS12h后,观察小鼠的眼睛、粪便、毛发及应激反应等,进行症状评分;采用FITC标记的葡聚糖观察肠道通透性的改变;处死小鼠后,取临近回盲部的部分回肠及结肠,观察肠道大体形态的改变,进行常规病理、透射电镜及激光共聚焦显微镜检查。刮取小肠黏膜,采用蔗糖密度梯度离心法提取膜蛋白,Western blot检测肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白的分布变化;激光共聚焦显微镜观察MLCK的表达及分布,Western blot检测肠黏膜上皮细胞MLCK及胞核内NF-κB的表达。数据用SPSS13.0统计软件作单因素方差分析(LSD);两组之间的比较采用Dunnettt检验,检验水准α=0.05。结果:内毒素血症组小鼠毛发粗糙、大便较稀、眼结膜充血;肠黏膜通透性较对照组显著增加;常规病理显示,肠绒毛萎缩、变短;透射电镜下观察到内毒素血症小鼠肠上皮紧密连接结构疏松、桥粒消失;激光共聚焦显微镜结果表明紧密连接蛋白表达减少,并从绒毛表面向隐窝移位;Western blot结果显示内毒素血症状态下紧密连接蛋白从不可溶膜组分向可溶膜组分转移。BBR预处理组小鼠症状评分及病理评分均较内毒素血症组显著增高,且BBR预处理能够减轻紧密连接的损伤、抑制紧密连接蛋白在肠黏膜表面及膜微区域的移位;BBR短期处理对内毒素血症状态下紧密连接的损伤无明显的保护作用。内毒素血症状态下肠黏膜MLCK的表达增加,NF-κB从胞浆向胞核内转移;BBR预处理能够抑制内毒素血症状态下MLCK的高表达,抑制NF-κB从胞浆向胞核转移;BBR短期处理对这种改变则无明显影响。结论:内毒素血症状态下,肠上皮紧密连接结构及功能均有不同程度的破坏,BBR预处理不同程度的减轻了内毒素血症状态下紧密连接的破坏,这种保护作用可能是通过抑制内毒素血症状态下肠黏膜表面MLCK的高表达及抑制NF-κB从胞浆向胞核的移位产生的;BBR短期处理对紧密连接的损伤无明显保护作用。目的:建立大鼠肠缺血再灌注模型,观察肠缺血再灌注状态下肠上皮紧密连接的损伤;采用BBR预处理的方法进行干预,观察肠上皮紧密连接结构及功能的改变,证实BBR对肠缺血再灌注状态下紧密连接损伤的保护作用,并阐明其作用的部分机制。方法:雄性SD大鼠24只,8-10周龄,200-250g,随机分为4组:对照组、BBR预灌胃组、肠缺血再灌注组、BBR预处理+肠缺血再灌注组。BBR预灌胃组剂量为200mg/kg,每天1次连续灌胃7天;肠缺血再灌注组,采用大鼠动脉夹夹闭肠系膜上动脉的方法,夹闭30min后放开动脉夹,第18h给予双糖灌胃(乳果糖13.3mg,甘露醇10.1mg),置于代谢笼中喂养,留取灌胃后6h全部尿液,采用高压液相色谱法检测乳果糖/甘露醇浓度比值;第24h处死大鼠,分光光度法测定血浆中D乳酸含量;取临近回盲部的部分回肠及结肠,行常规病理检查,透射电镜观察紧密连接超微结构,激光共聚焦显微镜观察紧密连接蛋白的分布及表达。刮取肠黏膜,利用NOS试剂盒测定肠黏膜中iNOS的含量;利用蔗糖密度梯度离心法提取膜蛋白,Western blot法检测肠黏膜上皮紧密连接蛋白在膜微区域分布的变化。结果:肠缺血再灌注组大鼠肠黏膜通透性及血浆中D乳酸含量显著高于对照组,肠黏膜绒毛结构紊乱、高度降低;紧密连接间隙增宽、疏松,桥粒密度降低;激光共聚焦显微镜显示紧密连接蛋白从绒毛表面向隐窝移位;Western blot结果显示肠缺血再灌注组大鼠紧密连接蛋白从不可溶膜组分向可溶膜组分转移;且缺血再灌注大鼠肠黏膜iNOS含量显著高于对照组。BBR预灌胃能够显著改善紧密连接的破坏、降低肠黏膜通透性、降低血浆中D乳酸含量、抑制紧密连接蛋白在绒毛表面及膜微区域的移位,并且显著降低肠黏膜表面iNOS活性。结论:BBR预灌胃能够改善肠缺血再灌注时肠上皮紧密连接的损伤,这种保护作用可能与BBR对肠黏膜iNOs活性的抑制作用有关。