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番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus，ARV)，其属于呼肠孤病毒属(Reovirus genus)禽呼肠孤病毒(Avian reovirus)的一员，具备禽呼肠孤病毒的一般生物学特性。临床中，此病在夏季番鸭中发病频繁，个体发病时间在4日龄～45日龄之间，发病率在20%～90%之间，但死亡比率差异较大，在约10%～30%之间。与其他病源混合感染率较高，甚至达90%以上。感染耐过番鸭个体一般表现为生长迟缓，变成僵鸭，对番鸭养殖的发展造成严重危害。该病毒基因，S3基因(片段大小1104bp)和S1基因(片段大小为810bp)，分别编码该病毒的σB外衣壳蛋以及σC吸附蛋白。已有研究表明，这两种蛋白能够诱导机体产生特异性中和抗体，控制病毒的感染。因此，本实验选取σB基因和σC基因，及两者的串联基因σB-σC，同时将σB-σC基因与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）串联，将以上四种蛋白原核表达，通过动物免疫试验，分析比较了四种蛋白的免疫效果。本研究以NCBI中公布的ARV序列为模板，设计了特异性的引物，利用RT-PCR方法从细胞培养ARV中扩增了ARV约为1100bp的σB基因和约为810bp的σC基因。将目的基因片段克隆到pMD18-T simple载体上，并进行酶切、PCR鉴定和序列测定，重组质粒命名为pMD18-T-σB和pMD18-T-σC。利用相同的酶切位点将σB和σC基因串联，构建了重组质粒pMD18-T-σB-σC。另外通过重叠延伸PCR的方法，将σB-σC基因与LTB串联，构建了重组质粒pMD18-T-σB-σC-LTB。将四个重组质粒经双酶切，回收目的基因片段，分别与经同样双酶切的大肠杆菌表达载体pET30b连接，转化感受态BL21，筛选阳性克隆，并进行酶切、PCR和测序鉴定，重组质粒命名为pET30b-σB，pET30b-σC，pET30b-σB-σC，pET30b-σB-σC-LTB。将以上四种阳性重组菌，经IPTG进行诱导表达，经SDS-PAGE分析表明σB蛋白，σC蛋白，σB-σC蛋白，σB-σC-LTB四种蛋白均获得了正确的表达，分子量分别约为42kD，35kD，78kD，90kD。将表达的蛋白进行Western blot分析可知，四种蛋白都能够与ARV的阳性血清产生特异性的结合。证明这几种蛋白具备了有良好的免疫原性。四种蛋白均以包涵体形式表达。对包涵体进行提取、纯化和复性。将复性后的蛋白免疫SPF雏鸡，观察四种蛋白免疫效果。分别于免疫前、初次免疫后第7d、14d、21d、28d、35d收集雏鸡血清，经间接ELISA试验检测血清抗体产生情况。结果表明，四种蛋白实验组与免疫组比较可知，在免疫后第7天，利用间接ELISA方法检测免疫后不同时间点雏鸡血清抗体的变化。结果表明，四种蛋白免疫组均在免疫后第7d就出现了血清抗体。加强免疫后，抗体水平逐渐升高，第35d时达到最高，与对照组PBS组相比均差异极显著（p＜0.01）。四种蛋白免疫组雏鸡产生的血清抗体情况比较可知σB-σC-LTB蛋白免疫组高于σB-σC蛋白组，高于蛋白σC组，高于σB蛋白组。这些结果表明，这些重组蛋白具有较好的免疫原性，均能刺激机体产生良好的抗体水平，为进一步的临床动物保护试验提供了基础。