研究背景和意义视神经是由视网膜神经节细胞(retinal ganglioncells,RGCs)的轴突汇聚而成,RGCs的状态一定程度上反应了视神经的功能。作为中枢神经的一部分,视神经伤后恢复亦成为研究的热点和难点。众多的调控因素使视神经损伤后再生修复变得异常困难、复杂。损伤区抑制性蛋白的存在、胶质瘢痕形成以及神经营养因子缺乏等因素是中枢神经再生障碍的主要原因,其中抑制性因素处于重要地位。Sema3A作为重要的轴突抑制物,在神经损伤后诱导生长锥塌陷,阻止神经修复,扮演着重要的调控角色,受到广泛的关注。神经纤毛蛋白(Neuropilin1,NRP1)和丛状蛋白(Plexin A1-A4,PlexA1-A4)被证实为Sema3A的共受体,与Sema3A结合后发挥对神经生长的抑制作用,当配体Sema3A不存在时,Plex以一种自我抑制的状态存在,共受体NRP1与Plex结合使得这种抑制状态更加稳定,在Sema3A与NRP1结合后,Plex的构象发生了改变,从自我抑制状态释放,进一步与Sema3A、NRP1结合,启动下游的信号传导,最终引起神经生长锥塌陷,抑制轴突延伸。p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases p38MAPK)和caspase-3信号通路参与了多种细胞凋亡进程。文献报道,Sema3A能激活p38MAPK,使其磷酸化后将促进神经祖细胞凋亡。而且,Sema3A还能减少巨噬细胞对髓磷脂的吞噬作用,抑制中枢神经髓鞘再生,妨碍神经营养因子运输,阻止损伤神经恢复。microRNA(mi RNA)是一种独特的内源性小分子,它通过与靶mRNA的3’UTR的互补配对抑制靶基因活性或使其降解,导致相应蛋白表达水平降低,从而调节细胞的增殖、分化与凋亡,在生物体生长发育的不同阶段发挥不同功能,实现其生物调节作用。而且,许多mi RNAs在哺乳动物大脑、视网膜中特异性存在并且在其各个发育阶段动态表达,表明了这些miRNAs与哺乳动物神经发育密切相关。这些研究结果为找寻抑制Sema3A表达的mi RNAs、促进损伤视神经修复提供了新的思路。目的:通过对视神经损伤后视网膜中Sema3A及其下游信号通路的研究,初步探讨Sema3A抑制视神经再生的作用机制,明确Sema3A是mi R-30b的靶基因,证实mi R-30b可通过调控sema3a表达并抑制其信号通路、发挥保护视网膜神经节细胞、促进轴突生长的作用,为临床治疗视神经损伤提供新的靶点和思路。方法:1、建立sd大鼠视神经钳夹损伤模型,于正常及伤后第1、3、7、14、21d行qrt-pcr和westernblotting检测,观察视网膜中mir-30b、sema3a、nrp1、plexa1、p-p38mapk、和activecaspase-3表达变化,免疫组织化学观察正常及伤后第7d视网膜上sema3a的表达情况。2、双荧光素酶报告基因系统验证mir-30b与sema3a3’utr结合并抑制其表达;将重组腺相关病毒(raav)包装的mir-30bmimic、mir-30binhibitor、mirnanc和pbs分别转染到体外培养的rgcs;培养第7d,westernblotting检测sema3a、nrp1、plexa1、p-p38mapk和activecaspase-3表达情况;制作sd大鼠视神经损伤模型,将raav-mir-30bmimic、raav-mir-30binhibitor、raav-mirnanc和pbs分别注射入损伤眼玻璃体腔内,分别于伤后3、7d用qrt-pcr和westernblotting检测视网膜中mir-30b、sema3a的表达量。3、构建以sema3a为靶标的sirna,lipofectamine2000将其转染到体外培养的rgcs,westernblotting检测sema3a表达量,选取最强抑制效果的sirna,再将其转染到体外培养的rgcs,培养第5d再分别转染raav-mir-30bmimic和raav-mir-30binhibitor,培养第9dwesternblotting再检测nrp1和p-p38mapk的表达情况,初步明确mir-30b调控sema3a的信号通路。4、将raav包装的mir-30bmimic、mir-30binhibitor、mirnanc和pbs分别转染到体外培养的rgcs;培养第5d流式细胞仪检测其凋亡率,培养第7d采用gap-43着染,免疫荧光显微镜观察各组rgcs轴突长度情况。5、制作sd大鼠视神经钳夹伤模型,将raav-mir-30bmimic、raav-mir-30binhibitor、raav-mirnanc和pbs分别注射入损伤眼玻璃体腔内,利用荧光金逆行标记观察伤后7、14、28d时4组rgcs存活率变化;闪光视觉诱发电位检测伤后28d各组视功能恢复情况。结果:1、sd大鼠视神经钳夹伤后,视网膜中mir-30b表达先升高后下降,伤后3d达高峰,伤后7d又逐渐下降,视网膜中sema3a、nrp1、plexa1、p-p38mapk和activecaspase-3也先升高后下降,伤后7d达高峰;免疫组化检测发现,sema3a表达在正常视网膜中内核层和节细胞层,伤后7d,节细胞层和内核层的阳性细胞明显增多。2、双荧光素酶报告基因系统检测发现处理组相对荧光素酶活性明显低于对照组和突变组,mi R-30b与Sema3A的结合位点为:UGUUUACA;转染miR-30b到体外培养的RGCs,mi R-30b mimic组中Sema3A、NRP1、PlexA1、p-p38MAPK和active caspase-3表达量最低,而mi R-30b inhibit组最高;大鼠视神经钳夹伤后,玻璃体腔内分别注射r AAV-miR-30b mimic、rAAV-mi R-30b inhibitor、rAAV-mi RNA NC和PBS,伤后3d和7d,视网膜中,miR-30b表达量在mimic组最高、inhibitor组最低,而Sema3A正好相反。3、在体外培养的RGCs中,si RNA2组内Sema3A蛋白表达量最低,用siRNA2敲低Sema3A后,再分别转染r AAV-mi R-30b mimic和r AAV-miR-30b inhibitor,两组中Sema3A、NRP1和p-p38MAPK表达量无明显差异。4、转染mi R-30b到体外培养的RGCs,流式细胞仪检测发现mi R-30b mimic组RGCs凋亡率最低,mi R-30b inhibit组最高,RGCs轴突长度mi R-30b mimic组最长,mi R-30b inhibit组最短。5、大鼠视神经钳夹伤后,玻璃体腔内分别注射rAAV-mi R-30b mimic、r AAV-miR-30b inhibitor、rAAV-mi RNA NC和PBS,虽然,伤后四组RGCs存活率都不同程度下降,但是在伤后7、14、28d,mimic组的RGCs存活率都最高,inhibitor组都最低;FVEP显示,mimic组中P1波幅也是最宽,inhibitor组最窄。全文结论1、离体及在体实验证实,Sema3A是miR-30b的靶基因;2、miR-30b可通过抑制Sema3A表达改变p-p38MAPK和active caspase-3的水平,减少RGCs凋亡,提高视神经损伤后RGCs存活率;3、miR-30b可通过抑制Sema3A表达改变NRP1、Plex A1的水平,促进RGCs轴突生长,并加快视神经损伤后视功能恢复,这可能是mi R-30b促进损伤后视神经修复的主要分子机制。