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中红侧沟茧蜂(Microplitis mediator Haliday)是一种广谱性的内寄生蜂,隶属于膜翅目(Hymenoptera)、茧蜂科(Braconidae)、小腹茧蜂亚科(Braconidae)、侧沟茧蜂属(Braconidae),于1979年首次在中国被记录,可用于生物防治低龄鳞翅目害虫,如:棉铃虫(Helicoverpa arwigera Hubner)和粘虫(Mythimnna separata Walker)的低龄幼虫。本次试验主要研究的是中红侧沟茧蜂触角中高表达的气味结合蛋白MwedOBP18 和气味受体 MwedOR19、MwedOR25、MwedOR48 的定位和功能。通过荧光免疫技术,在雌性中红侧沟茧蜂触角的锥型感器I中定位到气味结合蛋白基因MmedOBP18,推测其功能与中红侧沟茧蜂近距离识别和味觉识别作用有关,使用荧光竞争结合实验,筛选识别的潜在配体分析,确定其具有的嗅觉和味觉识别功能;另一方面,通过原位杂交实验,在雄性触角中定位气味受体基因MmedOR19,在雌性触角中定位气味受体基因MmedOR25、MmedOR48,并利用电压钳技术对潜在配体鉴别,确定了MmedOR19、MmedOR25、MmedOR48的主要功能也参与到了对寄主或寄主生境的信息识别过程中;最后通过EAG技术,对识别的挥发物配体分别用雄性、雌性触角验证。综上所述。本次实验通过荧光免疫组化和原位杂交技术分别对气味结合蛋白MwedOBP18 和气味受体MwedOR19、MwedOR25、MwedOR48 在触角中进行定位,使用荧光竞争结合和电压钳技术探寻了与其相结合的配体,验证了其相关的功能,确定了以上四种蛋白在中红测沟茧蜂的化学感知的重要作用。1.定位气味结合蛋白MmedOBP18在触角锥形感器I中。利用荧光免疫组化技术,通过蛋白定位,确定MmedOBP18在中红侧沟茧蜂触角上的分布情况,其可以观察到在锥型感器I中大量聚集,显示其功能可能与味觉有关。2.在中红侧沟茧蜂触角上定位了三种气味受体。通过原位杂交技术,在触角组织中以RNA探针连接生物素进行荧光标记,观察气味受体的分布情况,在中红侧沟茧蜂触角上对气味受体MwedOR 19、MwedOR2 5、MwedOR48一一定位。3.阐释了气味结合蛋白MmedOBP18配体结合识别特征。重组气味结合蛋白MmedOBP18配体结合特征,通过荧光竞争结合实验得到的配体分析,得出MnedOBP18 可以识别低挥发物,如:十一酸(Ki=6.58±0.02μmol/L)、十二酸(Ki=17.69±0.05μmol/L)、十三酸(Ki=11.68±0.08μmol/L)和十四酸(Ki=6.49±0.03μmol/L)、十二醛(Ki=6.42±0.03μmol/L)、癸醛(Ki=15.73±0.05μmol/L)、2-十一酮(Ki=10.36±0.06μmol/L)、2-十三酮(Ki=5.21±0.02μmol/L)、癸醇(Ki=11.63±0.07μmol/L)以及辛烷(Ki=14.37±0.04μmol/L)以及鳞翅目性信息素顺-9-十四碳烯醛(Ki=9.09±0.06μmol/L)、顺-11-十六碳醛(Ki=11.67±0.03μmol/L),以上配体能够与MmedOBP18重组蛋白结合。而且MmedOBP18与不挥发植物次生物质棕榈酸(Ki=3.86±0.02μmol/L)、亚麻酸(Ki=6.51±0.03μmol/L)、槲皮素(Ki=5.08±0.02μmol/L)以及棉酚(Ki=5.07±0.01μmol/L)也表现很强的结合能力。气味结合蛋白MmedOBP18与不挥发物的结合说明了其存在的味觉识别功能,而与低挥发气味物质的结合暗示其可能也同时具有嗅觉识别的功能,这对于中红侧沟茧蜂化学通讯机制的研究有着深远的影响。4.阐释了三种中红侧沟茧蜂气味受体的气味配体识别特征。中红侧沟茧蜂气味受体OR的体外真核表达,通过反转录合成cRNA,注射入爪蟾蛙卵细胞,进行体外真核表达,通过电压钳技术对中红侧沟茧蜂气味受体识别的潜在配体进行筛选。MmedOR25基因只鉴定出辛醛为20±4.3 nA,MmedOR19基因能鉴定出壬醛和辛醛反应,分别为48±1.8 nA、20±7.5 nA。然而,MmedOR48的反应是十分明显,并且显示了各种气味剂配体的广泛识别谱。MmedOR48基因主要识别植物挥发物中醇类和醛类。气味配体的反应以正辛醛、壬醛和癸醛为最大,电流分别为 296±61.3 nA、509±107.7 nA、424±85.1 nA。使用 10-8mM、10-7 mM、10-6 mM、5×10-6 mM、10-5 mM、5×10-5 mM、10-4 mM、5×10-4 mM至10-3 mM的不同浓度刺激气味受体,发现其反应随着浓度增加而增大,暗示了其对于宿主生境化学信息识别的功能。5.验证了中红侧沟茧蜂对气味配体的识别特性。通过EAG技术,对中红侧沟茧蜂配体进行检测验证,包括癸醛、辛醛、十二醛、十一醛、庚醛、壬醛、顺十六碳醛、2-十一酮、2-十三酮、辛烷、红没药醇、癸醇、十一酸、十二酸和鳞翅目性息素顺9-14碳烯醛。结果证明,以上配体的确在中红侧沟茧蜂化学信息识别中发挥着重要作用;同时,MmedOBP18和MmedOR19、MmedOR25、MmedOR48的共同识别配体也说明了气味结合蛋白OBP和气味受体OR在中红侧沟茧蜂化学通讯是中都起着重要的作用。