研究背景钙化性主动脉瓣疾病是老年人群中一种常见的疾病。随着社会人口老龄化的进展,钙化性主动脉瓣疾病发病率正逐年上升,目前已经发展成为仅次于冠心病和高血压病的第三大心血管疾病。传统观念认为钙化性主动脉瓣疾病是“退行性”改变,是机体老化的一种体现,是退行性钙磷沉积不可修复的过程。最近的研究发现钙化性主动脉瓣疾病的发展可能是高度调节的自主过程,可能存在着一个复杂的多步骤的内在机制在发挥作用,而并非年龄导致的不可避免的结果,病变有可能通过药物逆转。由于发病机制尚未完全明确,目前临床上还没有针对该病的治疗性药物,因此对该病发病机制的研究显得尤其重要。越来越多研究证明了炎症在钙化性主动脉瓣疾病发生发展过程中起重要作用。首先,通过对瓣膜置换手术中被置换出来的主动脉瓣膜进行组织病理分析发现有炎症的证据。其次,由于在发生主动脉瓣钙化并狭窄的瓣膜里发现有与口腔感染一致的细菌证据,并且在实验兔子接种口腔细菌可以诱导出主动脉瓣病变,推测慢性口腔感染可能是主动脉瓣钙化和狭窄发病的重要机制之一。人主动脉瓣间质细胞是主动脉瓣膜最主要的细胞成分,而主动脉瓣钙化往往发生在瓣膜的间质部分,因此人主动脉瓣间质细胞在钙化性主动脉瓣膜疾病的发生发展过程中起关键作用。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是识别病原微生物的跨膜受体家族,主要通过识别保守的病原相关分子模式(PAMPs)感知病原微生物的存在,对之产生免疫炎症反应,在人类天然免疫系统中起到重要作用。目前已经发现哺乳动物中存在有13种TLRs,而TLR4是最早被发现且被研究最多的TLR,广泛存在于内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等多种细胞中。TLR4被生物配体识别及结合后,可以活化细胞内的信号传导通路,促进炎症介质的产生和释放。因此,TLR4在细胞的免疫与炎症反应中起着关键作用。近来研究已经发现人主动脉瓣间质细胞能够表达有功能的TLR4,刺激这种受体后能够引起心脏瓣膜间质细胞的炎症和成骨反应,这在钙化性主动脉瓣疾病发生发展的病理过程中起重要作用。间质细胞的炎症激活可以诱导单核细胞和巨噬细胞聚集和浸润,而炎症介质促进主动脉瓣膜钙化的作用已被多个研究证实,因此我们推测炎症是主动脉瓣疾病初始阶段的促发因素,继而促进主动脉瓣膜成骨反应和钙沉积,从而导致钙化性主动脉瓣疾病的发生和发展。核转录因子κB (NF-κB)广泛存在于真核生物中,是一个由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族。它作为信号传导途径中的枢纽,与免疫,肿瘤的发生、发展,细胞凋亡的调节以及胚胎发育等有着密切联系,是细胞内最重要的核转录因子。NF-κB在许多细胞刺激后介导的细胞内信息的转录调控中起核心作用,参与多种基因的表达和调控,它调控的基因编码急性期反应蛋白、细胞因子、细胞粘附分子、免疫调节分子、病毒瘤基因、生长因子、转录和生长调控因子等。在静息细胞中,NF-κB二聚体通过非共价键的形式与其抑制蛋白IKB结合而分散在细胞质内,当细胞受到肿瘤坏死因子(TNF)、脂多糖(LPS)等NF-κB激活剂刺激时,其抑制蛋白IKB解离和降解,NF-κB发生磷酸化,激活后的NF-κB进入细胞核,与DNA模块上的特异蛋白结合,诱导目标mRNA的产生,最后转录、生成和释放各种目标产物。Notch蛋白是一组高度保守的细胞表面跨膜受体,在哺乳动物细胞中含有四种亚型,Notchl,Notch2, Notch3以及Notch4,Notch受体的配体有Jagged1, Jagged2,Delta like ligand (D11)l、D113和D114。Notch被γ分泌酶裂解,释放出其胞内域NICD,而NICD能够调控细胞命运及调节细胞功能。近来有研究表明细菌产物和脂多糖能够激活单核巨噬细胞的Notchl受体,从而调节细胞功能。抑制细胞γ分泌酶,就可以抑制NICD1的产生,同时也减少了巨噬细胞中脂多糖诱导的炎症因子的产生。然而Notchl信号通路在主动脉瓣间质细胞中对TLR4介导的炎症反应所起的作用目前尚不清楚。白介素37(Interleukine37,IL-37)属于白介素1家族,而白介素1家族目前拥有11个成员。至今已有五种亚型的人类IL-37被报道,分别是IL-37、. IL-37b、IL-37c、IL-37d和IL-37e。目前尚未发现小鼠表达IL-37,但人IL-37能在小鼠体内发挥作用。IL-37普遍存在于扁桃体、皮肤、食道、胎盘、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌等组织及THP-1巨噬细胞,A549表皮细胞和外周血单核细胞等细胞中。IL-37能以低亲和力的方式与白介素18受体(IL-18R)结合但却不发挥激动或拮抗作用。除了胞外作用,IL-37也能在细胞内起作用,在细胞受到刺激后IL-37能转入核内并可能充当转录调节因子调节细胞功能。体内及体外研究均证明了人IL-37具有抗炎作用。体内实验,人IL-37转基因小鼠对结肠炎模型有保护作用。体外实验,巨噬细胞及表皮细胞转染IL-37后能显著降低LPS及IL-1诱导的炎症介质的表达。本研究中,我们假想TLR4激活能诱导人主动脉瓣间质细胞的炎症反应,而这种炎症反应在来自主动脉瓣狭窄病人瓣膜组织的主动脉瓣间质细胞比来自正常瓣膜组织的细胞更明显,TLR4信号通路与Notch1信号通路发生交互作用,从而调节TLR4诱导的炎症反应水平,而人IL-37能通过Notch1/NF-KB轴抑制TLR4诱导的炎症反应,因此本研究可能对寻找钙化性主动脉瓣疾病的潜在防治靶点提供理论依据。本研究中我们利用TLR4受体激活剂LPS刺激人主动脉瓣间质细胞的TLR4受体,探讨TLR4介导的炎症反应,以及Notchl信号通路和人IL-37对其的调节作用及可能机制,本研究将分三部分进行。第一部分TLR4与Notch1通路间的交互作用对人主动脉瓣间质细胞炎症反应的调节作用目的研究TLR4与Notch1信号通路间的交互作用对人主动脉瓣间质细胞炎症反应的调节作用。方法分别从正常主动脉瓣膜组织和主动脉瓣狭窄病人主动脉瓣膜组织分离出人主动脉瓣间质细胞,用TLR4激活物脂多糖(LPS)进行干预1到24小时。用免疫印迹方法分析细胞间粘附分子(ICAM-1)蛋白表达。用免疫印迹和免疫荧光染色方法分析Notch1信号通路的活化水平。用酶联免疫吸附(ELISA)方法分析单核细胞趋化蛋白(MCP-1),白介素8(IL-8)及Notch1特异性配体Jagged1的释放。应用γ分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch1的活化,应用基因沉默的方法减少Notch1蛋白表达量,减少Notch1活化分子NICD1的产生,用Notch1特异性配体Jagged1激活Notch1,然后分析TLR4介导的ICAM-1表达量及MCP-1和IL-8的分泌水平。结果LPS诱导人主动脉瓣间质细胞ICAM-1蛋白的表达,MCP-1和IL-8的释放,以及Notch1信号通路的活化。来自主动脉瓣狭窄病人主动脉瓣膜组织的主动脉瓣间质细胞比来自正常瓣膜组织的主动脉瓣间质细胞显示出更强的炎症反应和Notch1信号通路的活化以及更多的Notch1特异性配体Jagged1释放。γ分泌酶抑制剂DAPT能抑制Notch1信号通路的活化,同时抑制TLR4介导的ICAM-1蛋白表达,IL-8和MCP-1释放。用基因沉默的方法降低Notch1表达水平,能减少NICD1的生成量,同时也减少TLR4介导的ICAM-1蛋白表达量。Notch1受体的特异性配体Jagged1能增强TLR4介导的ICAM-1蛋白表达,IL-8和MCP-1的释放。结论LPS能诱导人主动脉瓣间质细胞的炎症反应及Notch1信号通路的活化,而且这些反应在来自主动脉瓣狭窄病人瓣膜组织的主动脉瓣间质细胞中更明显。Notch1通路的活化能调控TLR4介导的炎症反应,Notch1过度活化可能是主动脉瓣狭窄病人瓣膜组织来源的主动脉瓣间质细胞炎症反应增强的重要机制。第二部分Notch1通路在人主动脉瓣间质细胞中调节TLR4介导的NF-κB活化的机制研究目的探讨Notch1信号通路在人主动脉瓣间质细胞调节TLR4介导的炎症反应的机制。方法分别从正常瓣膜组织和主动脉瓣狭窄病人瓣膜组织分离出人主动脉瓣间质细胞,用TLR4激活物LPS处理细胞1到24小时。用免疫印迹和免疫组化方法分析Notch1蛋白基础表达水平,用免疫印迹和免疫荧光染色方法分析核因子κB(NF-κB)的活化水平,用免疫共沉淀方法分析NF-κB上游IKB激酶(IKK)和Notch1信号通路活化分子NICD1间的直接相互作用。用γ分泌酶抑制齐(?)DAPT抑制Notch1的活化,用基因沉默的方法减少Notch1蛋白表达量,用Notch1特异性配体Jagged1激活Notch1,然后分析TLR4介导的NF-κB的活化水平。结果LPS诱导入主动脉瓣间质细胞NF-κB的活化,其活化水平均在来自主动脉瓣狭窄病人瓣膜组织的主动脉瓣间质细胞中增高。来自主动脉瓣狭窄病人的主动脉瓣膜组织和问质细胞的Notch1蛋白基础表达水平比来自正常瓣膜的组织和细胞高。γ分泌酶抑制剂(DAPT)能抑制TLR4介导的NF-κB的磷酸化。用基因沉默的方法降低Notch1表达水平,可减少TLR4介导的NF-κB的磷酸化。Notch1受体的特异性配体Jagged1能增强TLR4介导的NF-κB的活化。免疫共沉淀结果显示NICD1与NF-κB上游的IκB激酶IKK有直接相互作用。结论LPS诱导人主动脉瓣膜间质细胞NF-κB信号通路的活化,其活化水平在来自主动脉瓣狭窄病人的细胞中增高。Notch1的活化分子NICD1能通过与IKK直接相互作用调节TLR4介导的NF-κB的活化水平,从而调控TLR4介导的炎症反应。第三部分IL-37对人主动脉瓣间质细胞中对TLR4诱导的炎症反应的调节作用及其机制探讨目的探讨IL-37在人主动脉瓣间质细胞中对TLR4诱导的炎症反应的调节作用及其相关机制。方法分别从正常瓣膜和主动脉瓣狭窄病人瓣膜分离出人主动脉瓣间质细胞,用IL-37蛋白多肽与TLR4激活物LPS进行干预。用免疫印迹方法分析IL-37、ICAM-1蛋白表达水平,NF-κB和Notchl信号通路的活化水平,用RT-PCR方法分析IL-37的mRNA表达水平,用免疫荧光方法分析NF-κB核内转位。用基因沉默的方法减少IL-37的表达,然后分析TLR4介导的ICAM-1蛋白表达量。结果来自主动脉瓣狭窄病人瓣膜组织和来自正常瓣膜组织的主动脉瓣膜间质细胞均有IL-37mRNA和蛋白的表达,其水平在来自病变瓣膜组织的细胞较低。IL-37能抑制TLR4介导的ICAM-1表达水平,此作用在来自病变瓣膜组织的细胞中更明显。用基因沉默的方法减少IL-37的表达水平,可以增加TLR4介导的ICAM-1表达量。IL-37干预能减少Notchl的活化水平,并降低TLR4介导的NF-κB的活化水平。结论IL-37在人主动脉瓣膜间质细胞中表达,相对于来自正常瓣膜组织的主动脉瓣间质细胞,其表达水平在来自病变瓣膜组织的细胞较低。IL-37能通过抑制Notch1/NF-κB信号转导通路从而调节TLR4介导的炎症反应。全文总结1.Toll样受体4(TLR4)与Notch1通路的交互作用在人主动脉瓣间质细胞中能调节TLR4介导的炎症反应。2.Notch1通路通过其活化分子NICD1与NF-κB上游Iκ3激酶IKK直接相互作用调节NF-κB通路的活性。3.TLR4与Notch1通路间过多的交互作用可能是钙化性主动脉瓣疾病发生发展的重要机制。4.白介素37(IL-37)可通过抑(?)(?)Notch1/NF-κB信号通路轴抑制TLR4介导的炎症反应,具有防治钙化性主动脉瓣疾病进展的潜力。