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背景与研究目的甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein, AFP)发现至今已有40年的历史,目前仍作为肿瘤尤其是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)的重要分子标记用于临床诊断、治疗及预后判断。近年的研究表明,在HCC的发生发展过程中,AFP绝非仅仅是一种伴随的癌胚蛋白,而是在HCC的增殖和凋亡中发挥着主要作用,但目前对AFP的具体功能和作用机制仍存在较多争议。本研究设计合成靶向AFP基因的StealthTM RNAi,转染高表达AFP的肝癌细胞株Huh7,有效沉默AFP基因的表达,研究AFP在肝癌细胞中的促增殖作用和凋亡抵抗效应,并探讨其凋亡抵抗效应的相关机制,为HCC的基因靶向治疗提供理论支持。方法1.电化学发光法,放免法以及ELISA检测AFP在肝癌细胞系HepG2, Huh7, SMMC7721以及肝正常细胞株Changliver中的表达水平。2.设计合成三条靶向AFP基因的StealthTM RNAi,采用脂质体转染肝癌细胞系Huh7。采用RT-PCR检测mRNA水平,ELISA和Western blot检测蛋白水平AFP基因的表达水平变化,以确定转染条件和筛选最佳干扰序列。3.选择最佳StealthTM RNAi沉默Huh7中AFP基因的表达,采用MTT比色法检测各组细胞的增殖活性；Hochest染色法和透射电镜检测细胞的凋亡情况；并用流式细胞仪进行凋亡率检测。4. Western blot检测凋亡信号通路的相关蛋白水平,探讨沉默AFP基因后诱导细胞凋亡的潜在机制。结果1.AFP在肝癌细胞系HepG2, Huh7中高表达,SMMC7721中低表达,正常细胞株Changliver中未检测到AFP的表达。2.三条靶向AFP基因的StealthTM RNAi在mRNA水平和蛋白水平均可明显抑制Huh7中AFP基因的表达；其中AFP-HSS304和三条StealthTM RNAi的cocktail对AFP基因的表达具有最强抑制效应,两者转染后72小时在mRNA水平的抑制率分别为97.4%和98.5%,蛋白水平的抑制率分别为94.57%和94.84%.3. AFP-HSS304和三条StealthTM RNAi的cocktail沉默Huh7细胞中AFP基因的表达后,与对照组相比,可以明显抑制细胞的增殖,两者转染后72小时对细胞增殖的抑制率分别为65.63%和67.72%；并可以诱发凋亡,Hochest染色法和透射电镜可以观察到明显的凋亡小体,转染后72小时流式细胞仪检测到早期凋亡率分别为60.73%和69.23%。4.Western blot检测结果显示,沉默AFP基因后Huh7细胞中突变型P53,Bcl-2, Procaspase-3以及线粒体中的Cytochrome C水平显著降低；而Bax以及细胞浆中的Cytochrome C水平明显升高。沉默AFP基因后诱导Huh7细胞凋亡可能是P53/Bax/ Cytochrome C/ Caspase-3凋亡信号通路所介导。结论1.靶向AFP基因的StealthTM RNAi可明显抑制Huh7中AFP基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。2.靶向沉默Huh7细胞中AFP基因的表达后,可明显抑制细胞的增殖,并可以诱发凋亡,以早期凋亡为主。3.沉默AFP基因诱导Huh7细胞凋亡可能是P53/Bax/Cytochrome C/Caspase-3凋亡信号通路所介导。4.AFP基因可以做为肝癌基因治疗的潜在靶点进行深入研究。