炎症是机体的一种自我防御机制,保护机体免受外来病原体的侵袭.炎症对多种疾病的发生发展起到了至关重要的作用,因此,对炎症的早期诊断及治疗具有重大的意义.纳米医学地迅速发展为炎症的诊断和治疗提供了广阔的平台,非侵袭性的光学技术除被广泛用于炎症成像以外,还可基于光动力效应对炎症发挥治疗作用.因光学技术自身的限制,如光源组织穿透较差、光敏剂靶向效率低等问题,使其应用受到一定局限.　　为提高炎症的光学成像和光动力治疗效果,本课题构建了集光学成像与光动力治疗于一体的活性氧响应性自组装发光纳米粒.特异性选择作用于高 ROS水平反应微环境,在没有外部光源的情况下,以自发光作内部激发光源,基于化学发光共振能量转移效应实现对炎症的光学成像和光动力治疗.　　方法　　1.活性氧响应性自发光两亲性聚合物的合成　　利用 EDC/NHS法先活化二氢卟吩 e6(Ce6)羧基,加入 2倍化学当量的鲁米诺(Luminol)50℃反应3天,随后再加入Ce6 2倍化学当量的分子量为2000的端氨基聚乙二醇继续反应4天,透析除杂,冻干,得活性氧响应性自发光两亲性聚合物材料(CLP).　　2.活性氧响应性自发光两亲性材料的表征　　对CLP材料进行红外光谱(FT-IR)、核磁氢谱(1H NMR)、质谱(MS)、紫外吸收光谱及荧光发射光谱表征.　　3.活性氧响应性自组装发光纳米粒的制备与形态学表征　　取适量活性氧响应性自发光两亲性聚合物溶解于水中,自组装形成活性氧响应性自组装发光纳米粒.通过透射电子显微镜观察 CLP 纳米粒形态;激光粒度仪测定其粒径和zeta电位.　　4.活性氧响应性自组装发光纳米粒的光谱学表征　　考察浓度和溶剂对 CLP 纳米粒紫外吸收光谱和荧光光谱的影响;利用光纤光谱仪表征 CLP 纳米粒自发光光谱以及氧化条件对其的影响.利用小动物活体成像仪采集 CLP纳米粒自发光信号,考察 CLP纳米粒浓度、活性氧(ROS)水平、活性氧清除剂等因素对体外CLP纳米粒自发光成像的影响.　　5. CLP纳米粒自发光组织穿透性考察　　在相同氧化条件下,小动物活体成像仪采集透过肌肉组织的自发光,对比 CLP纳米粒和Luminol的组织穿透能力.　　6. CLP纳米粒在体外中性粒细胞中的自发光特性考察　　3%巯基乙酸盐灭菌溶液刺激 4 小时后,抽提小鼠腹腔灌洗液,体外孵育中性粒细胞,考察其对 CLP 纳米粒摄取情况;CLP 纳米粒对用 PMA 刺激后的中性粒细胞自发光成像,考察胞内外自发光特性、持续时间、纳米粒浓度及细胞数量对发光强度的影响.　　7. CLP纳米粒对急性腹膜炎小鼠的成像研究　　小鼠腹腔注射酵母多糖建立急性腹膜炎疾病模型.分别采用腹腔注射和尾静脉注射的方式给予等剂量的CLP纳米粒和Luminol,自发光活体成像.　　8. CLP纳米粒对急性肝损伤小鼠的成像研究　　小鼠腹腔注射对乙酰氨基酚建立急性肝损伤疾病模型.尾静脉注射等剂量的CLP纳米粒和Luminol溶液,自发光活体成像.分离肝脏,离体肝脏成像.　　9. CLP纳米粒对急性溃疡性结肠炎小鼠的成像研究　　小鼠自由饮用 3%葡聚糖硫酸酯钠盐(DSS)溶液 7 天建立急性溃疡性结肠炎模型.直肠灌注等剂量的 CLP 纳米粒和 Luminol,自发光活体成像.分离结直肠,离体成像.　　10.通过CLP纳米粒自发光成像功能评估结肠炎疾病发展进程　　3% DSS溶液代替水任小鼠自由饮用,按饮用天数,分为第0、1、3、5和7天共五组,造成不同发展程度的急性结肠炎,观察小鼠生存状态,评估疾病指数.直肠灌注 CLP 纳米粒进行活体自发光成像.分离结直肠,对浸润中性粒细胞数量、组织中 H2O2、髓过氧化物酶(MPO)和炎症因子水平以及肠道组织 H&E 切片进行分析.　　11. CLP纳米粒小鼠体内药动学考察　　小鼠按25mg kg-1的剂量尾静脉注射CLP纳米粒,在规定时间点,取血,分离血清.分离脏器,制备组织匀浆液.血清和匀浆液按体积 1∶10 的比例加入甲醇沉淀蛋白.荧光光谱法检测不同时间点CLP纳米的血药浓度以及在各主要脏器中的分布.　　12. CLP纳米粒自发产生单线态氧考察　　利用单线态氧(1O2)化学捕获剂在 355nm 波段处的紫外吸光度相对减少值,考察不同 CLP纳米粒浓度、不同氧化条件和不同反应时间对 CLP纳米粒自发产生单线态氧的影响.　　13. CLP纳米粒治疗急性腹膜炎药效学评价　　用酵母多糖诱导急性腹膜炎,刺激1小时后,给予CLP纳米粒进行干预.5小时后抽提腹腔灌洗液进行中性粒细胞、氧化应激及炎症因子水平分析.另考察 CLP 纳米粒对急性腹膜炎疾病发展进程浸润中性粒细胞数的影响.　　14. CLP纳米粒治疗动脉粥样硬化药效学评价　　利用载脂蛋白 E 缺陷小鼠建立动脉粥样硬化( AS )模型,进行为期两个月的CLP 纳米粒光动力治疗,通过活体成像考察 CLP 纳米粒对动脉粥样硬化斑块靶向能力;通过对主动脉油红 O (ORO)染色、Movats染色分析斑块生长情况;通过免疫荧光和 TUNEL染色共聚焦显微镜观察分析斑块区域细胞构成和凋亡情况.测定主动脉组织氧化应激水平.并对治疗过程中的体重变化、脏器指数、血常规、肝肾功、血脂水平及组织学进行评价,考察长期给药对机体的影响.　　15. CLP纳米粒治疗动脉粥样硬化药效学机制初步探索　　通过细胞计数法和细胞迁移实验评价 CLP 纳米粒对动脉粥样硬化发生发展相关RAW264.7巨噬细胞及 Movas细胞增殖和迁移产生的影响.ORO染色评价 CLP纳米粒对巨噬细胞形成泡沫细胞的影响.　　16. CLP纳米粒的初步生物安全性评价　　通过MTT法评价CLP纳米粒对RAW264.7细胞的细胞毒作用.最大给药量法评价 CLP 纳米粒对小鼠的急性毒性,观察期间每天记录小鼠生存状态及体重变化;2周后,测定血常规、肝肾功、脏器指数,对脏器 H&E 染色切片进行组织病理学分析.　　结果　　1.通过FT-IR、1H NMR及MS对CLP材料的表征,证明了CLP材料的成功合成,CLP聚合物中Ce6∶Luminol∶PEG的摩尔比为2∶1∶1.　　2.CLP材料溶解于水中自组装成纳米粒,粒径为176±1 nm,电位为-19±2 mV.透射电子显微镜观察到 CLP纳米粒呈核壳胶束样球体.CLP纳米粒荧光强度随聚集程度增加而减小直至淬灭.　　3. 光纤光谱仪测定结果显示,在一定氧化条件下,CLP 纳米粒基于 Luminol 被氧化发出蓝光,通过化学发光共振能量转移效应激发 Ce6 发出近红外光波.化学发光共振能量转移效率受ROS水平的影响,氧化性越强,能量转移效率越高.　　4. CLP纳米粒体外自发光成像强度与纳米粒浓度、ROS水平成正比;与 ROS清除剂、MPO抑制剂成反比.在 MPO/H2O2/Cl-氧化条件下,CLP纳米粒能最大限度发挥自发光成像功能,其组织穿透能力强于Luminol.　　5. CLP 纳米粒能快速被中性粒细胞摄取并且在胞内进行自发光成像.CLP 纳米粒对 PMA刺激活化后的中性粒细胞自发光成像能力显著性提高.CLP纳米粒特异性选择作用于活化后具有高ROS水平的中性粒细胞进行自发光成像.　　6. 与化学发光小分子试剂 Luminol 相比较,CLP 纳米粒对急性腹膜炎、急性肝损伤及急性溃疡性结肠炎小鼠的自发光成像能力更强,可持续时间更久.CLP 纳米粒对模型小鼠成像的自发光强度显著性高于正常小鼠成像的自发光强度;自发光成像可被用于分辨正常或病理组织.　　7. CLP 纳米粒对不同程度的急性结肠炎小鼠进行成像,自发光信号强度随病程的加剧而增加.CLP 纳米粒自发光强度与疾病指数、中性粒细胞浸润数、H2O2及MPO水平等疾病相关指标呈正相关.　　8. 在适宜氧化条件下,不依赖于额外的外部光源,基于化学发光共振能量转移效应,CLP 纳米粒可自发产生单线态氧.单线态氧的产生与 CLP 纳米粒浓度、活性氧水平、反应时间呈正相关.　　9. CLP纳米粒能有效抑制急性腹膜炎小鼠腹腔中性粒细胞的浸润,并显著性降低氧化应激、炎症因子水平.　　10. 以位于组织深层部位的 AS模型考察 CLP纳米粒自发光光动力治疗炎症的效果.通过主动脉、主动脉根部及头臂干切片 ORO染色结果统计分析可知,CLP纳米粒能有效缓解动脉粥样硬化斑块的生长与发展;通过 TUNEL 染色,观察到 CLP 纳米粒对斑块区域细胞的凋亡产生抑制作用,维持了斑块的稳定性.相较于对照组,为期 2 个月的光动力治疗结束后,CLP 纳米粒治疗组小鼠的体重增长、脏器指数、血常规、肝肾功及脏器 H&E染色切片组织病理学分析都无显著性差异.CLP纳米粒光动力治疗组小鼠血脂水平及主动脉组织氧化应激水平显著性下降.　　11. 对 CLP 纳米粒治疗 AS 药效学机制进行初步探索,CLP 纳米粒能有效抑制RAW264.7 巨噬细胞和 Movas 细胞的增值和迁移,并对 RAW264.7 细胞源性泡沫细胞的形成有一定的抑制作用.　　12. CLP 纳米粒初步安全性考察发现,一定浓度范围内的 CLP 纳米粒不会对RAW264.7 细胞产生细胞毒,其半数抑制浓度为 498.8 μM.尾静脉注射剂量高达1000mg kg-1的CLP纳米粒不会对小鼠机体产生急性毒性.初步证明了CLP纳米粒具有一定的生物相容性.　　结论　　1. 利用酰胺键成功合成活性氧响应性自发光两亲性聚合物 CLP 材料,通过 1H NMR分析,CLP聚合物材料中Ce6∶Luminol∶PEG物质的量之比为2∶1∶1.　　2. CLP 聚合物材料在水溶液中自组装形成核壳胶束样纳米粒结构,形态规整、粒径均一.CLP 纳米粒在适宜氧化条件下,Luminol被氧化发出的蓝色光波基于分子间化学共振能量转移效应激发 Ce6 发射特征荧光光谱,光波红移,增加组织穿透性.CLP纳米粒体外自发光强度随其自身浓度的增加呈先增后减的趋势,并与 ROS水平呈正相关;ROS清除剂和MPO抑制剂能抑制其自发光行为.　　3. CLP 纳米粒被活化的中性粒细胞摄取后,自发光强度显著性增强且维持时间延长.CLP 纳米粒对胞内高 ROS 水平的中性粒细胞高度敏感,特异性选择作用于活化细胞,对正常细胞无自发光功能.　　4. CLP纳米粒被动靶向于炎症组织,特异性响应病理组织高 ROS微环境,对正常组织无响应性而不发挥成像功能.与小分子自发光试剂Luminol相比,更适宜作为深层组织炎症的自发光成像探针.另自发光成像不需外部激发光源,避免了机体组织自发荧光的干扰,提高信噪比.　　5. 不同病程的自发光成像结果与急性结肠炎疾病指数、中性粒细胞浸润数、MPO和 H2O2水平等疾病相关指标呈正相关.此方法有望成为一种利用非侵袭性成像手段对疾病发展进程进行示踪的新探索.　　6. CLP 纳米粒能有效促进急性腹膜炎的消退过程,具备一定抗炎效果.又能被动靶向富集于动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块位置,特异活性氧响应性发挥光动力治疗作用,可有效缓解斑块的生长与发展,抑制斑块中细胞的凋亡,维持斑块稳定性.且按25 mg kg-1的剂量长时间给药对机体无不良影响.　　7.体内外初步安全性评价表明,CLP纳米粒具有良好的生物相容性.　　综上,本课题构建了一个活性氧响应性自组装发光纳米粒,此系统对高 ROS 水平微环境产生特异响应性,Luminol 被氧化发出光子,基于化学发光共振能量转移效应,激发能量受体 Ce6 产生近红外光波,以实现体内外自发光成像;并伴随单线态氧的产生,达到原位光动力治疗疾病的目的.CLP 纳米粒被动靶向到炎症组织,特异性响应高 ROS 水平微环境;激发的近红外光波组织穿透能力增强,适宜于深层组织的自发光成像,能有效作用于急性腹膜炎、急性肝损伤和急性结肠炎发挥成像功能;成像结果与疾病相关指标呈正相关,可用于对急性结肠炎疾病发展进程的示踪研究;能有效抑制中性粒细胞的浸润,促进急性腹膜炎的消退过程,具备一定抗炎作用;原位自发光光动力疗法可有效抑制动脉粥样硬化斑块的生长与发展,维持斑块稳定性,缓解动脉粥样硬化发展进程.本系统有望运用到其他和 ROS 水平直接相关的疾病模型中,为传统光学成像和光动力疗法无法企及的疾病提供一种新的思路和策略.