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研究背景慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)是严重危害人类健康的常见病和多发病,但确切发病机制尚不完全明了,造成防治上的困难。因而COPD发病机制一直是该领域研究的热点。COPD是一种慢性气道炎症性疾病,以不完全可逆的气流受限为特征,气流受限呈进行性发展,是肺部对于有害颗粒或气体的异常的炎症反应。近年来的研究表明,天然免疫和获得性免疫均发挥了重要的作用,但中性粒细胞和巨噬细胞释放的炎症介质和蛋白酶成分在COPD发病中的作用似乎更为突出,研究人员推测天然免疫可能与COPD炎症损伤和组织重塑关系更为密切。人类内源性抗菌肽LL-37作为天然免疫系统的重要组成成分,是机体抵抗外界刺激的第一道防线。除传统的抗菌作用外,趋化活性、损伤修复、影响细胞凋亡及细胞毒性等多项功能日益引起人们的关注。我们在前期研究基础及回顾文献基础上,推测,具有广谱多效生物学功能的LL-37可能在COPD发病过程中发挥重要作用。对其状态的研究也有助于揭示天然免疫在COPD发病过程中的作用。目的检测COPD患者血清、诱导痰及肺组织标本中人类内源性抗菌肽LL-37的表达,并于细胞水平观察人支气管上皮细胞(BEP2D)、肺泡上皮细胞(A549)经香烟提取物(CSE)及细菌成分脂多糖(LPS)刺激前后LL-37的表达及LL-37合成多肽对BEP2D、A549炎症因子释放及细胞凋亡等的影响,以探讨内源性抗菌肽LL-37在COPD发病机制中的作用。方法1.选取稳定期COPD患者28例,健康吸烟者14例,健康非吸烟者18例,采集患者空腹外周血及诱导痰,ELISA方法检测血清及诱导痰中LL-37的水平。并行肺功能检测,填写圣乔治问卷以评价受试者生活质量,行6分钟步行试验以评价运动耐量。2.选取因肺部肿瘤、肺大疱、肺囊肿而行手术治疗的COPD患者9例,肺功能正常者10例,免疫组化方法检测肺组织标本LL-37的表达。3.培养人支气管上皮细胞(BEP2D)及肺泡上皮细胞(A549),使用不同浓度的CSE及LPS刺激细胞,免疫荧光化学染色,激光共聚焦显微镜检测BEP2D、A549经CSE、LPS刺激前后LL-37蛋白的表达。4.以不同浓度的LL-37合成多肽刺激BEP2D、A549细胞,ELISA方法检测炎症因子白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平,流式细胞仪检测LL-37对BEP2D、A549细胞凋亡的影响,半自动生化分析仪检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的水平。结果1. ELISA结果显示Ⅰ+Ⅱ级COPD及Ⅲ+Ⅳ级COPD患者诱导痰中LL-37水平显著高于健康非吸烟组(P<0.05)及健康吸烟组(P<0.05)。Ⅲ+Ⅳ级COPD组诱导痰中LL-37显著高于Ⅰ+Ⅱ级COPD组(P<0.05)。外周血中LL-37水平于各组间未见显著性差异。诱导痰中LL-37水平与患者肺功能FEV1%呈负相关(r=-0.32,P=0.01),与6分钟步行试验呈负相关(r=-0.27,P=0.01),与圣乔治问卷评分呈正相关(r=0.35,P=0.01)。2.免疫组织化学结果显示,LL-37主要表达于肺内的气道上皮细胞、肺泡上皮细胞、炎症细胞(包括中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)和成纤维细胞；COPD组支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞及炎症细胞LL-37呈强阳性表达,而对照组支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞及炎症细胞LL-37呈弱阳性表达。3.细胞免疫荧光化学染色,激光共聚焦显微镜观察结果显示,分别经不同浓度的CSE和LPS刺激后,BEP2D细胞、A549细胞LL-37呈显著增强的阳性表达。4. ELISA结果显示LL-37合成多肽可促进BEP2D、A549细胞炎症因子IL-8的释放(P<0.05)；流式细胞仪结果显示LL-37合成多肽可诱导BEP2D、A549细胞的凋亡,呈剂量-效应和时间-效应关系；LL-37合成多肽可增加BEP2D、A549细胞LDH的分泌。结论1. COPD患者诱导痰中升高的LL-37与患者气流受限程度,生活质量及运动耐量显著相关,COPD患者肺组织中LL-37表达亦明显增强,推测它们可能作为COPD疾病活动和进展的预测指标,有可能为COPD的治疗提供新的靶点。2.暴露于CSE、LPS的支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞LL-37的表达明显增加；3.LL-37合成多肽可促进支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞炎症因子的释放,诱导支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞的凋亡,提示LL-37在COPD的发病过程中发挥重要作用。