论文部分内容阅读
因疾病、交通事故或不当的体育运动造成的肌腱损伤是常见的临床问题。肌腱组织因具有少细胞、寡供血以及低代谢的结构特征,使受损肌腱,包括受损腱体和肌腱止点损伤的腱-骨区域,难以自愈。将干细胞与仿生支架复合的组织工程策略为有效修复损伤肌腱带来了希望。从全面仿生天然肌腱胞外基质（ECM）的组成、拓扑结构和力学性质的策略出发,我们认为,高取向性胶原纤维支架是肌腱腱体修复的理想支架,而分级取向的胶原纤维支架是腱-骨连接处修复的理想支架。由于难溶性胶原纤维（ICFs）拥有更多天然分子交联和分子排列,其自组装程度和力学性能更接近天然肌腱ECM,因此,我们进一步认为,ICFs比可溶性胶原更适合于肌腱修复支架的加工。但遗憾的是,目前以ICFs为原料的取向性纤维的加工技术较为缺乏。反向旋转挤出（CRE）技术适用于ICFs支架的加工,具有纤维取向性可调、加工速度快、可控性好等优点,但迄今为止却鲜有将其应用于肌腱修复支架的加工。据此,本文在探索了ICFs的提取条件和理化性能的基础上,以ICFs为原料,创新性地采用CRE技术制备出了不同取向的胶原纤维支架,并从理化性能、体外生物学性能和体内修复效果等方面系统地评估了各胶原纤维支架用于肌腱腱体/腱-骨缺损修复的可行性并分析了相关机制。主要研究内容和结论如下:（1）基于CRE技术构建不同取向性的胶原纤维膜（CMs）以牛皮为原料分离提取并纯化得到ICFs,以酶溶性胶原（PSC）为对照,通过凯氏定氮、高效液相色谱（HPLC）、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、傅里叶红外光谱（FTIR）和圆二色光谱（CD）对胶原蛋白的组成和结构进行了表征。结果表明:提取的ICFs和PSC为典型的I型胶原蛋白,具有完整的三股螺旋结构,其纯度和羟脯氨酸满足我国胶原蛋白海绵的行业标准（YY/T1511–2017）。理化性能测试发现:ICFs比PSC具有更高的交联度、热稳定性、酶解稳定性以及拉伸力学强度,更适合于胶原纤维支架的制备。进一步,以ICFs为原料,通过调节同轴内外旋转锥体的旋转速率调控ICFs取向,成功制得三种不同取向的CMs,即高取向性（CMa,取向分布为0°-15°）、中度取向性（CMm,取向分布为-15°–30°）和随机取向性（CMr,取向分布为-60°-60°）。热收缩率纵横比（S纵/S横）和热收缩力纵横比（F纵/F横）检测结果进一步验证了各CMs的取向程度。力学拉伸测试表明:三种CMs均具有优良的纵向拉伸性能,呈现CMa（18.45±0.91 MPa）>CMm（16.35±0.75 MPa）>CMr（13.81±0.39MPa）。以上结果提示,CRE技术加工的不同取向性CMs可以有效地仿生肌腱的化学组成、拓扑结构和力学性能。（2）取向性CMs对rBMSCs形态及分化行为的影响为了探究CMs纤维取向对干细胞行为的影响,以rBMSCs为模型细胞,采用SEM和免疫荧光染色技术观察了rBMSCs在CMs上的早期细胞形态,并进一步通过荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（WB）系统地探究了在正常和诱导培养基条件下各CMs对rBMSCs向肌腱系、成骨系和软骨系分化的影响。结果显示:高取向性CMa可以诱导rBMSCs呈纺锤状的伸长形态,促进rBMSCs向肌腱系分化并抑制其向成骨和软骨系分化,甚至具有一定的抵抗成骨/软骨诱导培养基的能力,提示CMa适合作为肌腱腱体的修复支架;相反,随着CMa、CMm和CMr取向程度依次降低,它们诱导rBMSCs向肌腱系分化的能力减弱而向成骨/软骨系分化能力增强,提示它们组合的分级取向结构有望作为腱-骨修复支架。（3）高取向性CMa-BMSCs支架对损伤跟腱腱体的原位修复为了考察CMa作为缺损腱体修复支架的可行性,我们将CMa作为支架材料,与种子细胞rBMSCs复合培养制得组织工程肌腱（CMa-BMSCs）。将CM-BMSCs植入裸鼠皮下2周后发现rBMSCs仍然存活,且CMa可以诱导细胞和沉积胶原纤维的取向。进一步,采用大鼠跟腱缺损模型,以自体肌腱缝合作为阳性对照,空缺作为阴性对照,CMr-BMSCs为实验对照,检测了CMa-BMSCs对损伤腱体的原位修复效果。宏观评分、跟腱功能指数（AFI）测定、核磁共振成像（MRI）、常规病理分析、生物力学评价、以及肌腱相关基因和蛋白的表达情况表明,CMa-BMSCs可以促进体内肌腱系分化,对缺损腱体的修复质量明显优于CMr-BMSCs,与自体肌腱修复质量基本相当,证明CRE构建的基于ICFs的高取性CMa是修复损伤肌腱腱体的良好支架。（4）分级取向CMar-BMSCs支架对腱-骨连接处原位修复的初探将CMa和CMr复合制得分级取向支架(CMar),以考察CMar对腱-骨区域的修复效果。力学拉伸测试、免疫荧光染色和ALP染色结果表明,CMar具有良好的力学稳定性且能够诱导rBMSCs呈现分级的细胞形态和分化倾向。在此基础之上,进一步采用大鼠跟腱-跟骨缺损模型初步评估了CMar-BMSCs对腱-骨缺损的原位修复能力。X光检测和micro-CT结果显示:在跟骨区域,CMar-BMSCs与CMr-BMSCs的新骨生成量相当,而在肌腱腱体区域,CMar-BMSCs没有出现CMr-BMSCs所呈现的明显钙化影。HE和MT结果显示:在肌腱腱体区域,CMar-BMSCs与CMa-BMSCs胶原纤维均组装成熟且趋于有序化,而在腱-骨界面区域,只有CMar-BMSCs出现了纤维软骨移行带而CMa-BMSCs没有。以上结果表明:CMar-BMSCs在腱端具有与CMa-BMSCs相似的促肌腱修复并抑制异位成骨的能力,在骨端具有与CMr-BMSCs相似的促骨修复能力,以及良好的促腱-骨界面修复能力,证明CRE构建的基于ICFs的分级取向CMar是修复损伤腱-骨区域的良好支架。综上所述,本论文运用CRE技术成功构建了三种不同取向（CMa、CMm、CMr）的难溶性胶原纤维支架,并证实高取向性CMa和分级取向CMar通过仿生化学组成、拓扑结构和力学性能而可以实现肌腱腱体和腱-骨缺损的有效修复。相关研究结果为肌腱腱体/腱-骨组织工程理想支架的制备提供了一条新的途径,对于推进肌腱组织工程的应用进程有重要意义。