猪繁殖与呼吸综合症是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒,其基因组大小为15kb左右。PRRSV基因组包含9个开放开放阅读框,分别编码病毒的复制酶(ORF1a和1b),4个膜相关的糖蛋白(ORFs 2a至5),2个非糖基化的膜蛋白(ORF2b and ORF6),和N蛋白(ORF7)。PRRSV的复制酶被至少3个由病毒自身编码的蛋白酶酶解。通过氨基酸序列的比对分析,非结构蛋白NSP4被推测具有3C样丝氨酸蛋白酶活性,并使用His39-Asp64-Ser118作为催化三联体。此外,推测PRRSV NSP4的底物结合区包括Thr113、His133等氨基酸残基。这两个氨基酸残基在3C样半胱氨酸蛋白酶中也是保守的,并负责酶对底物切点(Gln/Glu)↓(Gly/Ala/Ser)的特异性。 为了研究PRRSV NSP4的生化特性和结构特征,在大肠杆菌表达系统中表达了野生型NSP4、突变体H39R、突变体D64V、突变体S118Y、突变体H133L以及N末端截短型NSP4、C末端截短型NSP4,并经镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化获得了高纯度的重组表达蛋白。对纯化的重组表达蛋白进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,结果表明这些重组蛋白在大肠杆菌系统中获得正确的表达。利用合成的多肽底物S(LGSLLEGAFRT)和反相高效液相色谱技术,建立了定性检测PRRSV NSP4酶活性的方法。利用该方法我们检测了NSP4野生型、突变型、末端截短型等重组表达蛋白的酶活性。野生型NSP4能在体外酶解多肽底物S,酶切产物经MALDI-TOF质谱测定其分子量,结果表明底物多肽S中的Glu↓Gly肽键被切断,从而得到了预期的产物。说明野生型NSP4具有3C样丝氨酸蛋白酶活性。而4个NSP4突变体和2个末端截短型NSP4均不表现出3C样丝氨酸蛋白酶活性,说明His39、Asp64、Ser118、His133等氨基酸残基是PRRSV NSP4 3C样丝氨酸蛋白酶活性所必须的。从而证实了关于His39-Asp64-Ser118组成PRRSV NSP4 3C样丝氨酸蛋白酶催化三联体以及His133是PRRSV NSP4底物结合位点的推测。同样,N末端和C末端氨基酸残基也都是PRRSV NSP4 3C样丝氨酸蛋白酶活性所必须的。 分子筛层析和SDS-PAGE分析表明PRRSV NSP4在体外的溶液中存在着大量的聚体,即使在浓度(0.2mg/ml)较低的条件下也有大量的二聚体生成,且有少量的三聚体。随着蛋白浓度的升高(2mg/ml),聚体显著增多。推测二聚体是PRRSV NSP4 3C样丝氨酸蛋白酶的主要活性形式。N末端截短型NSP4在体外主要以三聚体形式存在,即使在低浓度(0.2mg/ml)条件下也是如此。C末端截短型NSP4在体外主要以单体形式存在,即使在高浓度(2mg/ml)条件下也是如此。这个结果表明C末端对于PRRSV NSP4单体的二聚化是必须的,它在酶单体二聚化过程中起着关键作用。猜测N末端对PRRSV NSP4二聚体起稳定作用,防止NSP4单体的三聚化或多聚化。 使用圆二色光谱仪对PRRSV NSP4野生型、突变型、末端截短型等重组表达蛋白的二级结构进行研究。结果表明NSP4以β折叠为主要的结构特征,点突变H39R、D64V、S118Y、H133L都对PRRSV NSP4结构有不同程度的影响。N末端或C末端截短对PRRSV NSP4的二级结构构成产生了显著的影响,使PRRSV NSP4的二级结构成为混合型的结构。这表明N末端和C末端序列都是PRRSV NSP4维持正常构象所必须的。