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目的高分子量激肽原（high molecular weight kininogen，HK）是凝血系统接触因子之一，在许多病理生理学过程中发挥重要作用，如纤维蛋白溶解作用、血栓形成和炎症等。HK由重链、含缓激肽（bradykinin，BK）肽段和轻链三部分组成。重链包括D1～D3区，BK组成部分居于D4区，轻链包括D5和D6区。HK被激肽释放酶活化释放缓激肽形成双链高分子激肽原（cleaved high molecular weight kininogen，HKa），HK转变为HKa发生了较大的构像变化使D5区暴露更加明显，HKa由于各区域的重新排列获得了新的功能，具有较强的抗粘附效应。研究已发现HKa轻链富含组氨酸区域（histidine-rich domain，HRD），即D5区是HKa抗细胞伸展的活性区域，也是HKa抑制血管生成的活性区域，因此被Colman等称作激肽抑制素。最初Colman等提出HKa和D5区可以抑制血管生成，并进一步证实了HKa能抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增生并诱导其凋亡，提示这是它们抑制血管生成的关键步骤。此外，Katkade等发现HKa和D5区通过裂解与尿激酶型纤溶酶原活化物受体（uPAR）结合启动的信号通路诱导内皮细胞凋亡。肿瘤细胞经常过度表达uPAR，而目前的研究中所采用的肿瘤细胞系较少，HKa对不同肿瘤的作用是否存在异质性，以及负责其发挥抑制活性的核心氨基酸序列还需深入研究。本实验旨在进一步明确HKa轻链D5区抑制肿瘤细胞的分子机制，渴望发现D5区发挥活性作用的最小功能区。实验材料1、MDA-MB-231细胞株2、HK D5区重组蛋白及其合成肽3、WST法检测细胞增殖活性的相关试剂4、Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡的相关试剂实验方法1、多肽合成依据HKa的402～502残基序列合成P-5（479-493）、P-5n（480-487）、P-5m（484-491）和P-5c（488-495）共4种选择肽，通过高效液相色谱法纯化，纯度为90％以上。2、HK r-HRD的制备扩增编码氨基酸从His411到Trp 501的HK cDNA，PCR引物：上游引物5-CCGGCATATGTCTAGACCCAACCATTGTGTGCTTTCC-3′，下游引物5′-CCGGCATATGCATGACTGGGGCCATG-3′。为便于克隆，在上游引物5′端引入NdeⅠ酶切位点，下游引物引入一个XbaⅠ酶切位点。3、细胞培养MDA-MB-231细胞培养采用含8％小牛血清，100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的RPMI-1640培养基。培养条件：37℃，湿度100％，CO2浓度为5％。4、细胞增殖分析用WST法检测r-HRD及HKa D5区合成肽对MDA-MB-231细胞增生的影响。接种对数生长期细胞于96孔板，加入2umol/L r-HRD及不同浓度的HKa D5区合成肽，培养22h后，加入10ul WST-8溶液后继续培养2h，酶标仪测定450nm吸光度，完全培养基作为空白对照，每个浓度重复6个孔。5、细胞形态的观察于倒置相差显微镜下观察各实验组及对照组NIA-MB-231细胞形态及贴壁情况。6、流式细胞仪检测细胞凋亡分别收集2umol/L r-HRD及200、400、800umol/L HKa D5区合成肽处理24h的细胞，Annexin/PI双染色，流式细胞仪检测，每份标本检测10 000个细胞，计算凋亡百分率，记录、存储和分析结果。实验结果1、HK r-HRD及HKa D5区合成肽P-5、P-5n、P-5m能抑制MDA-MB-231细胞增殖，P-5c无抑制细胞增殖作用。2、相差显微镜观察细胞形态改变，发现肽P-5、P-5n、P-5m处理组细胞体积缩小，变圆，细胞生长受抑制、活力下降，P-5c处理组与对照组相比无差异。3、HK r-HRD及HKa D5区合成肽P-5、P-5n、P-5m能诱导MDA-MB-231细胞凋亡，随着浓度的增加，细胞凋亡率升高，P-5c无诱导细胞凋亡的作用。结论HK r-HRD及HKa D5区合成肽P-5、P-5n、P-5m体外对MDA-MB-231细胞有显著的抗增殖作用。HK r-HRD及HKa D5区合成肽P-5、P-5n、P-5m对MDA-MB-231细胞的抗增殖作用是通过诱导细胞凋亡实现的，HGK序列可能是其发挥活性作用的核心序列。