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反刍动物瘤胃微生物发酵产生的短链脂肪酸(SCFA)是反刍动物主要的能量来源,可提供机体所需能量的60-80%。据估算瘤胃内产生的SCFA,50-85%会被瘤胃上皮所吸收。目前的研究表明,日粮精料水平影响瘤胃上皮对SCFA的吸收能力,但其中的机理尚不清楚。本论文以反刍动物瘤胃上皮为研究对象,意在研究日粮精料水平对瘤胃上皮SCFA吸收相关载体表达的影响及其机制。第一章日粮精料水平对山羊瘤胃上皮SCFA吸收相关载体mRNA表达的影响及其机制12只山羊随机分成低精料组(LC,m＝6)和中等精料组(MC,m＝6),分别饲喂精料含量为10%与35%的两种日粮。试验期间,山羊于每日的8：00与18：00饲喂,且自由饮水。试验进行21天后,山羊在晨饲后6小时屠宰,采集瘤胃液及瘤胃上皮样品。体外试验选取8只健康山羊,屠宰采集瘤胃上皮,胰蛋白酶消化获得瘤胃上皮细胞后进行原代培养,待24 h细胞附着后,分别接受以下处理：pH7.4、 pH6.8. pH7.4+SCFA (20 mM SCFA)与pH6.8+SCFA处理。处理24h小时,收集细胞待检。采用气象色谱法测定瘤胃内挥发性脂肪酸(SCFA)含量,Real-time PCR法检测基因表达。结果显示：与LC组山羊相比,MC组屠宰时瘤胃液内SCFA的含量显著升高,而瘤胃液的pH值显著低于LC组。此外,山羊体内试验的结果还显示,增加日粮精料含量促进山羊瘤胃上皮中SCFA转运载体(MCT1、MCT4、DRA、PAT1和AE2)及pHi调节蛋白(NHE1、NHE2、NHE3、vH+ATPase和Na+/K+ATPase)的基因表达(P<0.05)。体外试验结果显示,酸处理(pH6.8)促进山羊瘤胃上皮细胞MCT1 mRNA的表达,但会降低瘤胃上皮细胞中AE2的表达(P<0.05)。在pH7.4的培养液中添加SCFA (20mM)引起瘤胃上皮细胞中DRA, PAT1, AE2, MCT1和Na+/K+ATPase的mRNA水平升高,但会降低vH+ATPase的mRNA水平(P<0.05)。与对照组(pH7.4)相比，酸与SCFA共同作用(pH6.8+SCFA)引起瘤胃上皮细胞中DRA, PAT1, AE2, MCT1和Na+/K+ ATPase的mRNA表达增加(P<0.05)。上述体内外的结果表明,日粮精料水平通过瘤胃内的SCFA与pH影响山羊瘤胃上皮中SCFA吸收相关载体(SCFA转运载体与pHi调节蛋白)的mRNA表达。第二章日粮精料水平及禁食对山羊瘤胃上皮NHE1及NHE3表达的影响及可能的机制26只山羊随机分组,分别进行两项试验(试验一,n=16；试验二,n=10),且在两项试验中山羊均被分为两组：花生杆组(PNS组；试验一,n=8；试验二,n=5)和花生杆加精料组(PNSC组；试验一,n=8；试验二,n=5)。两组山羊均自由采食花生秆和饮水,且PNSC组山羊在每天8：00、11：00、14：00和17：00分别饲喂精料100克。试验进行42天后,试验一的山羊在采食后2小时屠宰取样,而试验二的山羊则在禁食16小时后屠宰取样。山羊瘤胃上皮细胞的分离及原代培养的方法同第一章。采用气象色谱法检测瘤胃内SCFA的含量,Real-time PCR和Western blot万法分别检测样品基因与蛋白的表达。结果显示：在试验一中(连续饲喂条件),同PNS组相比，PNSC组山羊瘤胃液SCFA含量显著升高(P<0.05),而瘤胃液pH值显著降低(P<0.001)。但试验二中,在禁食16h的条件下两组山羊瘤胃液中的总SCFA含量及瘤胃液pH均不存差异(P>0.05)。连续饲喂条件下,高精料日粮促进山羊瘤胃上皮中NHE1与NHE3的基因与蛋白表达(P<0.05)；但在禁食16小时的条件下,不同精料水平间NHE1与NHE3的基因与蛋白表达没有差异(P>0.05)。与连续饲喂的PNSC组山羊相比(试验一),禁食条件下PNSC组山羊瘤胃上皮中NHE1与NHE3的基因与蛋白表达显著下降(试验二)；禁食引起两组山羊瘤胃上皮中泛素-蛋白酶体途径相关基因(Nedd4-1、β-Arrestin-1、蛋白酶体C8亚基和蛋白酶体C9亚基)的表达显著升高(P<0.05)。体外试验的结果显示,SCFA(尤其是丁酸)与酸处理都促进NHE1和NHE3基因与蛋白的表达(P<0.05)；此外他们还影响山羊瘤胃上皮细胞中NHE1蛋白降解相关基因(Nedd4-1、β-Arrestin-1、蛋白酶体C8亚基和蛋白酶体C9亚基)的mRNA表达(P<0.05)。上述体内外的结果表明,日粮精料水平及禁食通过瘤胃腔内因子(SCFA与pH)调节瘤胃上皮NHE1和NHE3的蛋白表达；禁食引起的瘤胃上皮NHE1蛋白水平下降与泛素-蛋白酶体途径相关基因的表达升高有关。第三章日粮精料水平对奶牛瘤胃上皮NHE1和NHE3表达的影响及其机制选择4头装有永久性瘤胃瘘管,健康无病的荷尔斯坦奶牛进行本次试验。试验分2期,每期分别饲喂精料含量为60%(高精料组,HC)与20%(低精料组,LC)的两种全混日粮。试验期间,每天8：00与17：00分两次饲喂奶牛,并保证其自由饮水。每期的最后一天(第15天)采集样品。体外试验选取4头健康奶牛,屠宰采集瘤胃上皮,胰蛋白酶消化获得瘤胃上皮细胞后进行原代培养,待24 h细胞附着后,分别使用胰岛素(50μg/L)、胰岛素受体抑制剂(50μM/L)、ERK抑制剂(20μM/L)和AKT抑制剂(15μM/L)处理细胞(0-1h或24h)。处理结束后,收集细胞待检。采用气象色谱法检测瘤胃内SCFA的含量；Real-time PCR和Western blot方法分别检测基因与蛋白的表达；采用放射免疫法检测奶牛血浆胰岛素的含量。奶牛体内试验的结果显示高精料日粮导致奶牛瘤胃内SCFA含量升高,pH下降,血浆胰岛素浓度升高(P<0.05)。高精料日粮促进奶牛瘤胃上皮NHE1和NHE3基因与蛋白的表达,提高胰岛素受体mRNA表达,还增加瘤胃上皮中AKT、ERK与p70S6K1蛋白的磷酸化水平(P<0.05)。这些体内试验的结果表明,高精料日粮激活了奶牛瘤胃上皮中的AKT、ERK及mTOR通路。体外试验的结果显示,与对照组(0min)相比,胰岛素处理(50μg/L)显著提高原代培养瘤胃上皮细胞ERK1/2和AKT蛋白的磷酸化水平(P<0.05)；胰岛素对瘤胃上皮细胞1ERK1/2、AKT及p70S6K1蛋白磷酸化的促进作用被胰岛素受体抑制剂[HAMPA-(AM)3]所抑制(P<0.05)；胰岛素促进瘤胃上皮细胞中NHE1和NHE3的基因与蛋白表达(P<0.05),而这种促进作用被Insulin受体抑制剂、ERK抑制剂和AKT抑制剂所抑制(P<0.05)。体外试验的结果表明,NHE1mRNA的表达受Insulin-ERK通路的调节,NHE3 mRNA表达受Insulin-ERK通路和Insulin-AKT通路的调节；ERK及AKT通路都参与Insulin对于NHE1与NHE3蛋白表达的调节；胰岛素激活奶牛瘤胃上皮细胞中的mTOR通路。上述体内外的结果表明高精料日粮通过胰岛素及其受体后通路(ERK与AKT)促进奶牛瘤胃上皮NHE1和NHE3基因与蛋白的表达；并提示高精料日粮通过胰岛素-mTOR通路促进奶牛瘤胃上皮NHE1和NHE3的蛋白表达。综上所述,本论文的研究表明日粮精料水平通过瘤胃腔内因子(SCFA与pH)以及血浆胰岛素影响瘤胃上皮中SCFA吸收相关载体的表达。