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[背景目的]赖氨酰氧化酶3(Lysyl Oxidase like 3,lox13)是一种铜依赖性胺氧化酶。有研究显示,过表达loxl3基因的小鼠较对照组正常小鼠外周血辅助性T淋巴细胞17(T helper cell 17,Th17)的数量明显减少,提示lox13蛋白的表达与小鼠的Th17细胞分化相关。该研究表明lox13通过与细胞核中的信号传导及转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)结合,破坏细胞核内STAT3二聚化,消除STAT3转录活性,从而限制Th17的分化。Th17 是一种能够分泌白介素 17(interleukin 17,IL-17)A、IL-17F、IL-6 及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factora,TNF-a)等的T细胞亚群。其分化受细胞核内转录因子视黄酸受体相关的孤儿核受体(Orphan nuclearreceptor gamma t,RORyt)的调控,而RORyt的激活依赖于信号传导及转录激活因子3的磷酸化(Phosphorylation-Signal transducer and activator of transcription 3,P-STAT3)。Th17细胞不仅在机体的防御及自身免疫性疾病中起到重要作用,在肿瘤的发生发展中也具有重要意义。目前有大量的研究表明,结肠癌中Th17细胞的局部浸润及其分泌的IL-17水平促进肿瘤的生长。因此,寻求一种阻断Th17细胞分化的方法,可能成为治疗结肠癌的一种途径。但人Th17细胞分化是否与lox13基因的表达具有相关性,以及是否可以通过干预T细胞loxl3基因的表达水平,影响其对结肠癌细胞的结局,目前尚不清楚。我们的研究,首先是证实人Th17细胞分化与lox13基因表达的相关性,研究干预T细胞loxl3基因表达水平对结肠癌细胞结局的影响。[方法]细胞来源:采集健康志愿者的外周血,通过人外周血淋巴细胞分离液及磁珠筛选获得人外周血T细胞;探讨lox13基因的表达在Th1、Th2及Th17三个细胞亚群中的表达情况:首先将T细胞分为4组:Th1组、Th2组、Th17组(分别在Th1、Th2及Th17培养条件下培养)及空白对照组(仅添加CD3、CD28抗体);其次采用CD3、CD4流式抗体标记T细胞胞膜上的CD3、CD4受体,5小时后破膜固定,Th1、Th2及Th17组分别用IFN-y、IL-13及IL-17A流式抗体标记,空白对照组用IFN-γ、IL-13及IL-17A流式抗体标记标记,并用流式细胞仪检测三种细胞亚群的百分比;用WB及qRT-PCR检测3种细胞亚群中lox13的表达情况;WB检测三种细胞亚群中P-STAT3及RORyt的表达;构建过表达/干扰沉默loxl3基因的重组质粒:首先构建loxl3过表达的重组质粒,从NCBI中调取loxl3的基因序列采用合成技术合成重组质粒并测序;其次构建loxl3干扰沉默的重组质粒,根据loxl3的基因序列,设计干扰序列后合成重组质粒并测序;构建过表达/干扰表达loxl3基因的病毒载体并转染T细胞,首先使用293T细胞及慢病毒包装试剂盒包装病毒,获取病毒原液;其次将包装好的病毒转染T细胞,分为5组:过表达loxl3基因的T细胞组(A组)、过表达loxl3基因的空载体T细胞对照组(B组)、干扰沉默表达loxl3基因的T细胞组(C组)、干扰表达空载体T细胞对照组(D组)、T细胞空白对照组(Control组),最后通过WB和qRT-PCR验证各组中loxl3基因的表达;探讨loxl3基因的表达与Th17细胞分化的相关性:将A组、B组、C组、D组及Control组在Th17细胞诱导条件下培养,首先通过WB检测P-STAT3及RORyt的表达情况;其次采用CD3、CD4流式抗体标记T细胞胞膜上的CD3、CD4受体,5小时后破膜固定,用IL-17A流式抗体标记细胞内的IL-17A,并用流式细胞仪检测各组Th17细胞的百分比;探讨T细胞与结肠癌SW620细胞共培养对T细胞loxl3基因的表达的影响:WB检测与结肠癌SW620细胞共培养的T细胞及空白对照组T细胞loxl3蛋白水平的表达情况;探讨过表达/干扰沉默loxl3基因的T细胞对结肠癌SW620细胞的杀伤作用。采用MTT检测A组、B组、C组、D组及Control组对结肠癌SW620的杀伤作用。[结 果]流式细胞学检测提示:Th1组中Th1细胞的百分比高于空白对照组,Th2组中Th2细胞的百分比高于空白对照组,Th17组中Th17细胞的百分比高于空白对照组;与Th1及Th2组相比,loxl3在Th17组中低表达,P-STAT3、RORyt在Th17组中高表达。质粒基因测序的结果验证过表达/干扰沉默loxl3的重组质粒的构建;WB、qRT-PCR检测提示A组loxl3基因在mRNA及蛋白水平的表达高于B组及Control组,C组loxl3基因在mRNA及蛋白水平的表达低于D组及Control组;A组RORyt在蛋白水平低于B组及Control组,C组RORyt在蛋白水平高于D组及Control组;流式细胞术检测发现A组Th17细胞亚群的比例低于B组及Control组,C组Th17细胞亚群的比例高于D组及Control组;通过WB及qRT-PCR检测发现,与结肠癌SW620细胞共培养的T细胞中loxl3的表达较空白对照组T细胞降低;MTT检测发现在T细胞数量/SW620细胞数量比例为10:1、15:1、20:1时,A组T淋巴细胞对结肠癌细胞SW620的杀伤作用较其他组增强。[结 论]本项研究,提示loxl3基因的表达与人Th17细胞的分化具有相关性,过表达loxl3基因可通过降低RORyt的表达从而抑制人Th17细胞的分化。T细胞与结肠癌SW620细胞共培养,可使T细胞loxl3的表达下降,增加了 T细胞向Th17细胞分化的可能,而过表达loxl3基因可抑制Th17的分化,从而增强T细胞对结肠癌SW620细胞的杀伤作用。