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肿瘤已成为严重危害人类健康和生命的高发病，其治疗手段主要包括化疗、手术、放疗及生物治疗等。其中，药物治疗在治疗肿瘤过程中具有举足轻重的地位。近年来，不断出现的新的抗肿瘤药物和靶向药物为肿瘤患者带来了新的希望。然而，耐药一直是当今肿瘤药物治疗中的一大瓶颈。肿瘤细胞对肿瘤药物产生抗药性，尤其是多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是肿瘤化疗失败的主要原因，也是肿瘤化疗领域急需解决的难题。MDR[1]是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同时，对结构和作用机制不同的其它抗肿瘤药物也产生交叉抗药性。研究表明，肿瘤的多药耐药与转运蛋白有关，主要有P-gp，MRP1，MRP2，MRP3和BCRP，他们都属于ABC转运体超家族的成员，均为降低胞内药物浓度的外排泵。乳腺癌耐药蛋白（Breast Cancer Resistance Protein，BCRP）是一类主要引起多药耐药的跨膜转运蛋白。建立稳定表达耐药蛋白细胞系是研究耐药相关蛋白的基础，鉴于此，本研究从MCF-7/ADR细胞中克隆了人BCRP基因，构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BCRP，并将其转染COS-7细胞，用600μg/ml的G418加压筛选，构建稳定表达BCRP蛋白的COS-7细胞系，并用BCRP底物mitoxantrone对鉴定阳性的细胞克隆进行转运活性验证。主要研究内容包括以下几个方面:1.人BCRP基因的克隆、序列分析及真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BCRP的构建根据GenBank上人BCRP基因序列（BC092408.1），用Primer Blast设计了一对扩增引物BCRP/Hind III-F和BCRP/BamH I-R，以提取的MCF-7/ADR细胞总RNA为模板，经RT-PCR扩增得到人BCRP编码区cDNA序列，并将其克隆至pMD-19T Simple载体。测序结果显示，克隆得到的序列全长1836bp，编码611个氨基酸，该序列与GenBank中基因及氨基酸序列同源性为100%。序列证实正确后，用Hind III和BamH I酶切连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上，构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BCRP。2. pcDNA3.1(+)-BCRP转染COS-7细胞及抗性细胞克隆的筛选将构建的表达人BCRP蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BCRP转染到COS-7细胞中，并用600μg/ml的G418持续药物筛选3周获得抗性细胞单克隆。3.稳定表达人BCRP蛋白的COS-7细胞系的鉴定及生物学活性检测采用基因组PCR、SDS-PAGE方法证实了人BCRP蛋白在所构建的细胞系中得到稳定整合并能高效表达，并用BCRP的底物米托蒽醌孵育细胞30min，破碎细胞，采用LC-MS/MS分析法检测胞内米托蒽醌的药物浓度，记录色谱图，用标准曲线法得到胞内米托蒽醌的浓度，并以裂解液中蛋白含量对单位时间内胞内药物积聚量进行校正。结果显示，经米托蒽醌处理后，高效表达BCRP阳性克隆胞内米托蒽醌的浓度远低于空载体转染的细胞，说明成功构建了BCRP稳定细胞模型并具有良好的生物学活性，此模型可用于BCRP相关药物转运研究。