【摘 要】
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D-阿洛糖是一种稀有糖,由于具有众多医疗保健功能,特别是抗肿瘤活性,而成为研究热点。近年来,D-阿洛糖生物制造越来越受重视。异构酶催化D-阿洛酮糖与D-阿洛糖之间的可逆转化是一种具有商业吸引力的酶反应制造D-阿洛糖的方法。核糖-5-磷酸异构酶B就是这样一种产D-阿洛糖的酶。在本研究中,Thermotoga lettingae TMO来源的核糖-5-磷酸异构酶在大肠杆菌中克隆表达,纯化获得了重组核糖
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D-阿洛糖是一种稀有糖,由于具有众多医疗保健功能,特别是抗肿瘤活性,而成为研究热点。近年来,D-阿洛糖生物制造越来越受重视。异构酶催化D-阿洛酮糖与D-阿洛糖之间的可逆转化是一种具有商业吸引力的酶反应制造D-阿洛糖的方法。核糖-5-磷酸异构酶B就是这样一种产D-阿洛糖的酶。在本研究中,Thermotoga lettingae TMO来源的核糖-5-磷酸异构酶在大肠杆菌中克隆表达,纯化获得了重组核糖-5-磷酸异构酶,并对其进行了性质研究。在此基础上进行了该酶的分子改造以研究其构效关系。最后建立了共表达系统用于双酶偶联反应将D-果糖生物转化为D-阿洛糖。主要的结论如下：用PCR方法扩增得到Thermotoga lettingae TMO的核糖-5-磷酸异构酶基因。该基因有438bp,编码一段145个氨基酸残基的多肽。将该基因插入pET-22b（+）载体,得到pET-rpiB质粒,接着将其转入E. coli BL21（DE3）受体菌。研究优化了重组菌株E. coli BL21/pET-rpiB的基因诱导表达条件,在28℃以1mMIPTG诱导6h得到最大表达。全细胞转化检测重组核糖-5-磷酸异构酶的活性。其产物经HPLC、LC-MS-MS、 FTIR以及1H-NMR鉴定确认为D-阿洛糖。利用阳离子交换树脂DTF-01分离纯化D-阿洛糖,考察柱温、上样体积以及流速对分离效果的影响。在上样体积8mL,流速1ml/min,柱温60℃时分离效果最好,分离得到纯度90%以上的D-阿洛糖。用Ni亲和色谱层析分离带His-Tag标签的重组核糖-5-磷酸异构酶可以达到电泳纯。SDS-PAGE和凝胶排阻色谱分析得到重组酶的分子量分别为17kDa和35kDa,说明该酶是由两个相同亚基组成的同源二聚体。用等点聚焦的方法测得重组酶的等电点为6.3。研究重组核糖-5-磷酸异构酶的性质,结果表明,酶在75℃,pH8.0时有最大酶活0.2Umg-1。该酶在pH8.0时有较好的稳定性。75℃时的半衰期为3.3h,说明该酶有较好的热稳定性。其动力学参数Km、kcat和催化效率（kcat/Km）分别为64mM、7.73min-1和0.12mM-1min-1。催化D-阿洛酮糖和D-阿洛糖之间的平衡参数为68：32。在同源建模、分子对接和定点突变等方法的基础上进行分子改造得到了T. lettingae核糖-5-磷酸异构酶的13个突变体。这些突变体是Gly66Ser、Gly66Ala、His133Asp、 His133Ala、Tyr42Phe、Tyr42Ala、His9Tyr、His9Ala、Arg132Glu、Arg132Ala、Arg136Glu、 Arg136Asp和Arg136Ala。其中正向突变有Gly66Ala、His9Ala、Argl32Glu和Arg132Ala,其酶活分别是未改造酶酶活的2.08、1.12、2.13和1.32倍。在此基础上对这些位点的功能进行了预测。将Clostridium cellulolyticum H10来源的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶和Arg132Glu突变体构建到一个表达质粒上得到共表达质粒pETDuet-Tlrpi-Ccdpe。将pETDuet-Tlrpi-Ccdpe转化大肠杆菌细胞并进行诱导得到含有两种酶的细胞,用于经济有效地生产D-阿洛糖的全细胞转化。以D-果糖为底物,经双酶偶联反应后,D-阿洛糖的产量为10.7%。在该双酶偶联生物转化过程中发现可逆的差向异构化反应的平衡有向增加D-阿洛酮糖的方向移动的趋势。
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