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前列腺干细胞抗原(Prostate stem cell antigen, PSCA)为含有123个氨基酸的糖蛋白,属于Thy-1/Ly-6家族GPI锚定的细胞表面抗原。研究表明,PSCA在正常前列腺组织中低表达,而在膀胱癌、胰腺癌及雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌组织中高表达;而且有研究表明,抗PSCA的抗体能够在体内抑制肿瘤的生长。以上研究为以PSCA为靶点的新型疫苗的研制奠定基础。如能以PSCA作为靶点,辅以合适的佐剂分子,利用基因工程技术获得重组蛋白疫苗,则有可能对相关的肿瘤起到积极的治疗作用。但是在本课题前期的研究中发现,PSCA蛋白难以表达,或是表达的PSCA蛋白可溶性很低,以包涵体的形式存在,且蛋白复性困难,使得疫苗研制难度加大,不利于PSCA蛋白疫苗的构建及免疫活性的研究。分析其原因,可能是由于PSCA为膜蛋白,本身结构复杂,含有多个半胱氨酸,不易折叠为正确的高级结构。因此,如何增强PSCA的可溶性表达,是当前研究的关键;同时,为评价重组蛋白的免疫效果,需要建立合适的小鼠前列腺肿瘤模型。本研究选取人源的热休克蛋白70(Heat shock protein70, HSP70)作为佐剂分子,将HSP70与PSCA基因进行融合表达,希望能够利用HSP70分子的佐剂功能和分子伴侣功能,同时增强PSCA蛋白的可溶性和免疫后机体的免疫水平,以构建用于治疗前列腺癌的重组蛋白疫苗。通过对PSCA及HSP70进行结构分析,我们构建了不同形式的融合基因,探索何种融合形式能够促进PSCA的可溶性表达,同时能够降低HSP70的抗原性,并保持HSP70增强抗原免疫效果的活性。首先扩增PSCA及HSP70基因,构建HSP70与PSCA融合基因。通过对PSCA进行结构分析,我们保留其活性结构域的部分即PSCA(T),然后将PSCA(T)、PSCA全长(FL)、HSP70基因分别克隆至pET21a(+)质粒中,构建重组质粒pET21-PSCA(T)-HSP、pET21-PSCA(FL)-HSP、pET21-HSP-PSCA(T)、pET21-HSP-PSCA(FL)。SDS-PAGE电泳分析表明PSCA(T)-HSP在E.coli中得到部分可溶性表达、HSP-PSCA(T)、HSP-PSCA(FL)大多为包涵体,而PSCA(FL)-HSP未得到表达;为了能够降低HSP70的抗原性并保持HSP70增强抗原免疫效果的活性,按结构域将HSP70分为HSPI及HSPII ,分别与PSCA(T)构建重组质粒pET21-PSCA(T)-HSPI、pET21-PSCA(T)-HSPII。SDS-PAGE电泳分析表明两者在E.coli中均得到可溶性表达。本研究最终拟选择PSCA(T)-HSP、PSCA(T)-HSPI及PSCA(T)-HSPII作为前列腺癌治疗性疫苗的候选研究对象。为了评价PSCA重组蛋白的免疫效果,我们建立了C57BL/6小鼠传统前列腺肿瘤动物模型。将小鼠前列腺来源的RM-1细胞稳定转染真核表达质粒pcDNA-PSCA,将筛选得到的稳定表达人PSCA基因的RM-PSCA细胞接种C57BL/6小鼠,结果表明实验小鼠全部成瘤,并且肿瘤生长迅速,小鼠平均存活37天,成功建立了表达人PSCA的小鼠肿瘤动物模型。然而由于传统肿瘤动物模型不能观察体内肿瘤的生长、转移情况;需要靠不同的时间侵入性地观察或宰杀动物以获得实验数据,不能反复跟踪研究;无法反映基因的时间性及空间性表达,为此我们建立了C57BL/6小鼠荧光素酶前列腺肿瘤动物模型,以更加方便、准确评价重组蛋白的免疫效果。为建立C57BL/6小鼠荧光素酶前列腺肿瘤动物模型,我们将真核表达质粒pcDNA-PSCA、pcDNA-Luc稳定共转染RM-1细胞,将筛选得到的稳定表达Luc及人PSCA基因的RM-PSCA/Luc细胞接种C57BL/6小鼠,建立荧光素酶小鼠动物模型。结果表明实验小鼠全部成瘤,肿瘤生长迅速,小鼠平均存活38天,转荧光素酶基因肿瘤细胞生物特性稳定,活体成像仪检测到转染荧光素酶细胞在小鼠体内活体成像,并且荧光素酶表达活性的强弱能够反映肿瘤大小;同时荧光素酶的表达并没有改变肿瘤的生长特性。本模型的建立为今后疫苗的研制奠定基础。