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第一部分P2X3受体选择性抑制剂延缓小鼠吗啡耐受的发生目的1、观察P2X3受体选择性抑制剂A-317491对小鼠吗啡耐受过程的影响;2、观察P2X3受体选择性抑制剂A-317491对耐受小鼠纳洛酮戒断症状的影响;3、观察P2X3受体选择性抑制剂A-317491逆转吗啡耐受的作用。方法本实验小鼠共分为四组:1、吗啡组(M组,n=14),每天两次腹腔给予10 mg/kg吗啡,连续七天;第七天给药2小时后每只小鼠腹腔注射5mg/kg的纳洛酮进行戒断实验(n=7);第八天进行单剂量A-317491逆转吗啡耐受的实验(n=7);2、抑制剂与吗啡组(AM组,n=14),每天两次腹腔给予10mg/kg A-317491,30分钟后腹腔给予10 mg/kg吗啡,连续七天;第七天给药2小时后每只小鼠腹腔注射5mg/kg的纳洛酮进行戒断实验(n=7);第八天进行单剂量A-317491逆转吗啡耐受的实验(n=7);3、单纯抑制剂组(A组,n=14)每天两次腹腔给予10mg/kg A-317491,连续七天;第七天给药2小时后每只小鼠腹腔注射5mg/kg的纳洛酮进行戒断实验(n=7);第八天进行单剂量A-317491逆转吗啡耐受的实验(n=7);4、生理盐水组(S组,n=14),每天腹腔给予生理盐水,连续七天;第七天给药2小时后每只小鼠腹腔注射5mg/kg的纳洛酮进行戒断实验(n=7);第八天进行单剂量A-317491逆转吗啡耐受的实验(n=7);每天的两次给药时间间隔12h,总的给药容积为1ml,给药天数为七天。每次给药30min后,对每只小鼠用纤维丝及甩尾法测定痛阈的变化,以此对小鼠吗啡耐受的情况进行判断。结果1、小鼠的行为学结果显示,给予吗啡第1天的镇痛效能最大,从第3天开始镇痛效应逐渐降低,连续使用7天后吗啡失去镇痛作用,而同时给予P2X3受体特异性抑制剂A-317491可以明显延缓该耐受过程的发生;2、纳洛酮戒断实验显示,与对照组相比,给予P2X3受体特异性抑制剂A-317491可以显著减轻小鼠对吗啡的依赖症状;3、第八天给予P2X3受体特异性抑制剂A-317491可部分恢复已耐受小鼠吗啡的镇痛效应。结论P2X3受体参与了小鼠吗啡耐受的发生,给予P2X3受体特异性抑制剂A-317491可以延缓小鼠吗啡耐受的发生;减轻其纳洛酮戒断症状;对于已发生耐受的小鼠,A-317491单次给药可部分恢复吗啡的镇痛效应。第二部分P2X3受体选择性抑制剂对大鼠鞘内吗啡耐受发生情况及DRG中P2X3受体表达的影响及其可能的机制目的1、观察鞘内给予不同天数吗啡对大鼠DRG中P2X3受体以及PKCε表达的影响;2、观察P2X3受体选择性抑制剂A-317491对大鼠鞘内吗啡耐受发生情况以及DRG中P2X3受体以及PKCε表达的影响;3、研究P2X3受体选择性抑制剂A-317491影响大鼠鞘内吗啡耐受的可能机制。方法鞘内置管成功的SD大鼠随机分为8组,每组7只:1、M3,M5,M7组,分别每天单次鞘内给15μg/10μl吗啡,继而用10μl生理盐水冲管,分别连续3、5、7天;2、M+A组,A-317491加吗啡七天,每天单次鞘内给15μg/10μl A-317491,30min后给15μg/10μl吗啡,每次给药后用10μl生理盐水冲管;3、A组,A-317491七天,每天单次鞘内给15μg/10μl A-317491,继而用10μl生理盐水冲管;4、M+epsilon-V1-2组,epsilon-V1-2加吗啡七天,每天单次鞘内给10μg/10μl epsilon-V1-2,30min后给15μg/10μl吗啡,每次给药后用10μl生理盐水冲管;5、Epsilon-V1-2组,epsilon-V1-2七天,每天单次鞘内给10μg/10μl epsilon-V1-2,继而用10μl生理盐水冲管;6、S组,每天单次鞘内给20μl生理盐水,连续7天。每天最后一次给药后30min检测大鼠后肢缩爪阈值,以及甩尾时间,以评估吗啡耐受情况。于给药后第8天测定痛阈后将大鼠处死,取L3~5节段背根神经节(DRG)进行蛋白印记和免疫荧光化学染色。结果1、鞘内给予P2X3受体特异性抑制剂A-317491以及PKCε受体抑制剂ε-V1-2可明显延缓大鼠吗啡耐受的发展;2、鞘内给予吗啡可致大鼠脊髓背根神经节中P2X3蛋白表达增加,而A-317491可以降低这种表达的增加;3、慢性鞘内吗啡处理可使大鼠脊髓背根神经节中PKCε的表达增加,而给予A-317491后可以抑制这种表达的增加。结论鞘内慢性吗啡处理可激活大鼠DRG神经元中的P2X3受体的表达,而选择性抑制P2X3受体可一定程度上抑制吗啡耐受的发生,该过程可能是通过降低PKCε的活性而达到的。