【摘 要】
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目的:探讨炎症模拟物LPS通过骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4,BMP4）促进猪主动脉瓣膜间质细胞（valve interstitial cells,VICs）成骨样分化的作用及机制,为钙化性主动脉瓣膜病（calcific aortic valve disease,CAVD）的干预及治疗提供理论依据。方法:采用茜素红组织染色和免疫组化法检测非CAVD组（n
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目的:探讨炎症模拟物LPS通过骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4,BMP4）促进猪主动脉瓣膜间质细胞（valve interstitial cells,VICs）成骨样分化的作用及机制,为钙化性主动脉瓣膜病（calcific aortic valve disease,CAVD）的干预及治疗提供理论依据。方法:采用茜素红组织染色和免疫组化法检测非CAVD组（n=1）和CAVD组（n=3）瓣膜组织中钙盐沉积以及Runt相关转录因子（Runt-related transcription factor 2,Runx2）、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、BMP4的表达;Western blot检测非CAVD组（n=1）和CAVD组（n=4）成骨指标Runx2、OPN,骨保护素（osteoprotegerin,OPG）,肌纤维样表型转变标志物α-SMA、collagen I,凋亡指标Bax,抗凋亡指标Bcl2和BMP4的表达;采用胶原酶（I型）消化瓣膜后分离猪VICs,用免疫荧光染色进行表型鉴定;采用LPS处理VICs,ALP染色和茜素红S染色分别检测VICs细胞早晚期成骨分化能力,q RT-PCR和Western blot检测Runx2、OPN、BMP4的表达,Western blot检测OPG、Bax、Bcl2的表达;VICs感染Ad-BMP4后,ALP染色和茜素红S染色分别检测VICs细胞早晚期成骨分化能力,q RT-PCR和Western blot检测Runx2、OPN、BMP4的表达,Western blot检测OPG的表达;VICs细胞在LPS诱导下感染Ad-si BMP4,ALP染色和茜素红S染色分别检测VICs细胞早晚期成骨分化能力,q RT-PCR和Western blot检测Runx2、OPN、BMP4的表达,Western blot检测OPG的表达;LPS处理VICs,Western blot检测p65、Smad1/5/8、Smad4和Smad7信号通路的变化;Western blot检测p65抑制剂Bay 11-7082在LPS诱导VICs成骨样分化和对BMP4表达的作用;Western blot检测VICs在LPS诱导下感染Ad-si BMP4后p65、Smad1/5/8、Smad4和Smad7信号通路的变化。结果:与非CAVD组相比,BMP4在CAVD组中明显升高,Runx2、OPN、OPG、collagen I和Bax在CAVD组中均显著高于正常组,Bcl2低于正常组,α-SMA无显著差异。原代猪VICs分离成功,α-SMA和vimentin阳性,CD31阴性。LPS可使VICs ALP活性增强,钙盐沉积增多,BMP4、Runx2、OPN、OPG和Bax表达明显增高,Bcl2表达被显著抑制。VICs细胞感染Ad-BMP4后与对照组相比,ALP活性增强,钙盐沉积增多,BMP4、Runx2、OPN和OPG表达明显增高。LPS处理VICs后,感染Ad-si BMP4,与对照组相比,ALP活性减弱,钙盐沉积减少,BMP4、Runx2、OPN和OPG表达被明显抑制。LPS作用于VICs细胞可使p-p65、p-Smad1/5/8表达明显增高,Smad4、Smad7信号通路激活;Bay 11-7082抑制剂可抑制p65信号通路的激活,抑制BMP4、Runx2的表达。VICs细胞在LPS处理下感染Ad-si BMP4,与对照组相比,p-Smad1/5/8表达降低、Smad4、Smad7信号通路的激活被明显抑制,其中p-p65表达无显著差异。结论:LPS可通过p65调控BMP4表达促进主动脉瓣膜间质细胞的成骨样分化,Smad1/5/8、Smad4和Smad7信号通路可能在此过程中发挥重要作用。
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