目的:肿瘤特别是恶性肿瘤是世界范围内人类死亡的主要原因之一，严重危害了人类的健康。近年来，恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年上升，对人类健康的危害日渐严重。肺癌是最常见的呼吸系统恶性肿瘤，在我国乃至全球范围是发病率和死亡率均居首位的恶性肿瘤，其中肺腺癌占40％以上。肺腺癌患者多数在初诊时即已是晚期并发生转移，预后不佳。目前肺腺癌主要的治疗策略仍是手术切除和术后放射及化学药物治疗。尽管近年来的治疗手段日益发展，但肺腺癌的5年生存率仍不能令人满意。因此，深入研究肺腺癌的病因学及新的治疗手段尤为迫切。　　手术治疗是目前肺腺癌的首选治疗手段，围手术期的化疗亦是肺腺癌的重要治疗手段，是手术治疗的有效补充。但是在临床上，近70％的肺癌患者在就诊时就已经处于局部晚期或者发生远处转移，在此种情况下，化疗和放疗成为大多数患者首选的治疗方案。然而在化疗过程中产生的化疗耐药降低了化疗的效果，限制了化疗的临床应用。因此，加强对肺癌特别是肺腺癌化疗耐药分子机制的研究显得尤为迫切。　　长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是长度大于200个碱基的非编码RNA，是近期分子生物学研究的热点，其在肿瘤病因学的研究也日益受到重视，相关报道日益增多，对长链非编码RNA的功能及分子机制的研究逐渐深入。长链非编码RNA可以在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多种层面上调控下游的功能基因的表达水平，能够参与细胞增殖、细胞周期、细胞分化、细胞凋亡以及细胞自噬性死亡等的调节，进而发挥其生物学作用。已有研究表明在肿瘤细胞中，某些特定的长链非编码RNA的表达水平会发生明显改变，提示特定的长链非编码RNA可能与该肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤中差异表达长链非编码RNA已经为肿瘤的诊断和治疗提供了新的方向。随着研究不断深入，长链非编码RNA在肿瘤发生进展中的作用以及调控基因的方式等的研究成果将为肿瘤的临床诊断和预后标志物的研究以及研发新的以长链非编码RNA为治疗靶点的治疗手段解开新的篇章。　　同时越来越多的研究还证实长链非编码RNA参与了众多肿瘤的化疗耐药过程，其中包括肺腺癌。例如，长链非编码RNA-HOTAIR能够通过沉默p21蛋白诱导肺腺癌细胞对紫杉醇的耐药性。H19敲除能够降低肺腺癌细胞对顺铂的反应性，高表达H19的肺腺癌患者的预后更差，顺铂化疗的效果不佳。　　长链非编码RNA KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1 Opposite Strand/AntisenseTranscript1，KCNQ1OT1)定位11p15.5，近期研究发现其在结直肠癌中存在表达及功能异常。而其在肺腺癌中的功能和分子机制及其与化疗耐药的关系迄今无深入的研究。在前期工作中，我们应用长链非编码RNA芯片筛查发现长链非编码RNA-KCNQ1OT1在肺腺癌中存在显著的高表达，提示KCNQ1OT1可能参与了肺腺癌的发生发展。基于对长链非编码RNA芯片结果的深入分析还发现KCNQ1OT1与MDR1基因存在显著的正相关，而MDR1参与化疗耐药的形成已被学者明确证实，提示KCNQ1OT1可能与肺腺癌的化疗耐药相关。因此我们开展如下深入的研究。　　本研究拟检测长链非编码RNA-KCNQ1OT1在肺腺癌组织及细胞系中的表达，并研究KCNQ1OT1对肺腺癌A549细胞增殖、细胞周期、凋亡和侵袭等细胞生物学表型的调节作用，以及其对肺腺癌紫杉醇耐药细胞A549/PA细胞化疗耐药性的调节作用。　　研究方法:　　1、TRIZOL法提取76例手术切除的肺腺癌组织及相应的癌旁组织的总RNA。实时定量PCR(qRT-PCR)检测其中KCNQ1OT1的表达。　　2、统计学分析明确KCNQ1OT1表达与肺腺癌患者的瘤体大小、分化程度、TNM分期以及淋巴结转移等临床病理信息的相关性。　　3、实时定量PCR检测正常支气管上皮16HBE细胞与肺腺癌A549细胞中KCNQ1OT1的表达。　　4、应用RNA干扰技术沉默A549细胞中KCNQ1OT1的表达，实时定量PCR验证沉默效果。　　5、MTT法检测KCNQ1OT1沉默对A549细胞增殖能力的调节作用。　　6、PI单标流式细胞法检测KCNQ1OT1沉默对A549细胞细胞周期的调节作用。　　7、双标流式细胞法检测KCNQ1OT1沉默对A549细胞凋亡的调节作用。　　8、Transwell法检测KCNQ1OT1沉默对A549细胞的侵袭能力的调节作用。　　9、选取应用紫杉醇方案化疗的41例肺腺癌患者，参照RECIST疗效评价标准将其分为化疗敏感组（16例）和化疗非敏感组（25例），实时定量PCR检测两组中KCNQ1OT1的表达。　　10、获取对紫杉醇耐药的A549/PA细胞，检测A549/PA细胞对紫杉醇的半抑制浓度(IC50)，明确其对紫杉醇的耐药性。　　11、实时定量PCR检测A549细胞及A549/PA细胞中KCNQ1OT1的表达。　　12、应用RNA干扰技术沉默A549/PA细胞中KCNQ1OT1的表达，实时定量PCR验证沉默效果。　　13、 MTT法检测KCNQ1OT1沉默的A549/PA细胞对紫杉醇的半抑制浓度。　　14、Western Blot法检测KCNQ1OT1沉默的A549/PA细胞中多药耐受蛋白1(MDR1)的表达。　　结果:　　1、芯片筛查肺腺癌中表达异常的长链非编码RNA　　长链非编码RNA芯片筛查显示，长链非编码RNA-KCNQ1OT1在肺腺癌组织中的表达显著上调。　　2、肺腺癌组织及A549细胞中KCNQ1OT1的表达　　实时定量PCR检测76例手术切除的肺腺癌组织及A549细胞中的KCNQ1OT1表达。结果显示，与癌旁正常组织相比，肺腺癌组织中KCNQ1OT1表达明显增加;与对照的16HBE细胞相比，A549细胞中KCNQ1OT1表达显著增加。　　3、 KCNQ1OT1表达与肺腺癌患者临床病理信息的相关分析　　KCNQ1OT1的表达与肺腺癌的分化程度及病理分期相关。随着肿瘤体积的增大、分化程度的降低、TNM分期的增加以及淋巴结转移的出现，肺腺癌中KCNQ1OT1的表达明显增高。　　4、 KCNQ1OT1表达沉默对A549细胞恶性表型的调节作用　　实时定量PCR检测结果显示转染si-KCNQ1OT1能够显著抑制A549细胞中KCNQ1OT1的表达。KCNQ1OT1沉默能够显著抑制A549细胞的增殖活力和侵袭能力，阻滞A549细胞于G0/G1期，并诱导A549细胞发生凋亡。KCNQ1OT1沉默能够显著地抑制A549细胞的恶性生物学表型。　　5、 KCNQ1OT1在紫杉醇化疗敏感肺腺癌组织及紫杉化疗非醇敏感肺腺癌组织中的表达　　实时定量PCR检测结果显示，与化疗敏感组相比，化疗非敏感组肺腺癌组织中KCNQ1OT1表达显著增加。　　6、紫杉醇耐药细胞系A549/PA的验证　　对获得耐紫杉醇细胞系A549/PA进行检验，结果显示A549/PA细胞对紫杉醇的耐受性大幅度提高，存活率增加。　　7、 KCNQ1OT1在A549细胞及A549/PA细胞中的表达　　实时定量PCR检测A549细胞及A549/PA细胞中KCNQ1OT1的表达。结果显示，与A549细胞相比，A549/PA细胞中KCNQ1OT1表达显著增加。　　8、 KCNQ1OT1表达沉默对A549/PA细胞的紫杉醇化疗耐药性的调节作用　　实时定量PCR检测结果显示转染si-KCNQ1OT1能够显著抑制A549/PA细胞中KCNQ1OT1的表达。KCNQ1OT1沉默能够显著降低A549/PA细胞对紫杉醇的IC50值，抑制A549/PA细胞对紫杉醇的耐药性，并显著降低MDR1蛋白在A549/PA细胞中的表达。　　讨论:　　我们前期的长链非编码RNA芯片筛查中发现，KCNQ1OT1在5例肺腺癌组织中表达显著上调。然后，我们应用实时定量PCR检测了76例肺腺癌组织，大样本组织表达检测证实了KCNQ1OT1在肺腺癌中确实存在显著的表达上调。这与李静等在非小细胞肺癌中的研究结果相符，他们发现KCNQ1OT1在89例非小细胞肺癌中的表达水平明显增高。这初步证实KCNQ1OT1的表达异常可能与肺腺癌的发生发展相关。　　为了进一步明确KCNQ1OT1与肺腺癌的相关性，我们运用统计学方法分析了KCNQ1OT1表达与肺腺癌患者的临床病理信息的相关性。统计分析结果显示，KCNQ1OT1的表达与多种肺腺癌的临床病理信息相关，随着肺腺癌肿瘤体积的增大、分化程度的降低、TNM分期的增加以及淋巴结转移的出现，肺腺癌中KCNQ1OT1的表达明显增高。这进一步提示KCNQ1OT1与肺腺癌密切相关，可能在肺腺癌的进展和侵袭转移中发挥作用。　　KCNQ1OT1在肺腺癌中的功能尚不清楚，亦无相关文献报道。为此，我们应用RNA干扰技术沉默了肺腺癌A549细胞中的KCNQ1OT1表达，并检测其表达沉默对A549细胞的增殖、细胞凋亡及侵袭能力的影响。实验结果发现，KCNQ1OT1沉默能够显著抑制A549细胞的增殖活力和侵袭能力，阻滞A549细胞于G0/G1期，并诱导A549细胞发生凋亡。KCNQ1OT1沉默能够显著地抑制A549细胞的恶性生物学表型，在肺腺癌中发挥肿瘤促进作用，可能成为肺腺癌潜在的癌基因。　　化疗能够在一定程度上抑制肺腺癌的复发和转移，改善患者的预后。然而在化疗过程中产生的化疗耐药降低了化疗的效果，限制了化疗的临床应用。我们对KCNQ1OT1在肺腺癌组织中的表达情况进行深入的分析发现，KCNQ1OT1在对紫杉醇化疗不敏感的肺腺癌患者的瘤体组织中的表达显著上调，提示KCNQ1OT1可能参与肺腺癌的化疗耐药的发生。而且， KCNQ1OT1在对紫杉醇耐药的肺腺癌A549/PA细胞中的表达较其在A549细胞中的表达显著增高，进一步证实其表达异常可能与肺腺癌的化疗耐药相关。然后，我们沉默了A549/PA细胞中KCNQ1OT1的表达，发现KCNQ1OT1沉默能够显著降低A549/PA细胞对紫杉醇的IC50值，抑制A549/PA细胞对紫杉醇的耐药性。我们认为KCNQ1OT1参与了肺腺癌细胞化疗耐药的形成，沉默其表达能够显著抑制肺腺癌耐药细胞对紫杉醇的耐药性，KCNQ1OT1可能会成为肺腺癌新的治疗靶点。　　Gene Ontology(GO)分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析的结果显示KCNQ1OT1与MDR1基因存在显著的正相关。MDR1基因是目前已经明确的肿瘤化疗耐药相关基因，其编码的蛋白是位于细胞上的重要的ATP依赖的流出泵，其能够将化疗药物在其到达细胞质之前泵出细胞，阻止化疗药物发挥抗肿瘤作用。KCNQ1OT1沉默能够显著降低MDR1蛋白在A549/PA细胞中的表达。因此，我们推测KCNQ1OT1能够通过正性调节MDR1基因的表达，参与肺腺癌紫杉醇耐药的形成。　　上述研究结果说明KCNQ1OT1能够通过调节MDR1基因的表达，参与肺腺癌紫杉醇耐药的形成，可能是肺腺癌潜在的癌基因。上述研究成果为研究肺腺癌化疗耐药发生的分子机制提供了新的实验依据，进一步的研究将为明确肺腺癌的临床治疗提供新的靶点。　　结论:　　1.长链非编码RNA-KCNQ1OT1在肺腺癌中表达显著上调，且与肺腺癌的肿瘤体积、分化程度、TNM分期以及淋巴结转移相关。　　2.沉默KCNQ1OT1能够显著抑制肺腺癌A549细胞的增殖和侵袭能力，阻滞A549细胞于G0/G1期，并诱导A549细胞凋亡。　　3.KCNQ1OT1在对紫杉醇耐药的肺腺癌组织和细胞中表达显著上调，与肺腺癌的化疗耐药相关。　　4.沉默KCNQ1OT1能够显著抑制肺腺癌耐药细胞对紫杉醇的耐药性，并降低肺腺癌耐药细胞中MDR1蛋白的表达。