内毒素休克（endotoxic shock, ES）是临床各科常见的危重病理过程,内毒素休克及其合并症多器官功能障碍综合症是ICU患者最常见的死亡原因。在内毒素休克的发病早期,体循环血管舒张、平均动脉压（mean arterial pressure,MAP）进行性降低是其特征性病理变化。内毒素的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）及其诱导机体产生的促炎细胞因子可引起血管调控超氧化物岐化酶（superoxide dismutase, SOD）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitricoxide synthase, iNOS）的异常表达,氧自由基、一氧化氮（nitric oxide,NO）等生成增多,干扰血管的调节机制,可能是ES早期血压降低的重要原因。胆囊收缩素（cholecystokinin,CCK）是一种神经调节肽,广泛分布于机体的中枢神经系统、消化系统、免疫器官以及心血管系统,参与调节机体多种生理功能及病理过程。以往研究多偏重关注其拮抗阿片镇痛、消化内分泌等领域,近年来小分子八肽胆囊收缩素（cholecystokinin octapeptide,CCK-8）的心血管功能调节及细胞保护作用正成为研究的新热点。已有报道给清醒Long Even鼠静脉注射低剂量CCK-8,可引起肾、肠系膜和后下肢动脉收缩,大剂量则引起动脉舒张。本室的系列研究发现CCK-8具有明确的抗内毒素休克作用,可提高血管SOD的活性,抑制LPS诱导的血管平滑肌细胞iNOS活性增加、NO生成增多,缓解LPS诱导的血管反应异常变化,逆转ES大鼠MAP的下降及ES早期的肺动脉压升高,减轻各脏器病理损伤,明显降低内毒素休克大鼠的死亡率。CCK通过其靶细胞表面的CCK受体（CCK-R）发挥其生物学作用, CCK-R属于G蛋白偶联受体,根据其对内源性配基亲和力的不同可分为CCK-AR和CCK-BR 2种亚型。研究表明CCK受体非特异性阻断剂丙谷胺及CCK-AR/BR的特异性阻断剂CR-1409/2945可拮抗CCK-8的抗ES作用。LPS介导血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMC）活化的信号通路错综复杂。目前认为核因子кB （nuclear factor-kappa B,NF-кB）是参与LPS诱导细胞损伤的重要转录因子;LPS—LBP—PKC/ PTK—IKK—IκB—NF-κB—kinase是2条关键的信号通路,即LPS与LPS结合蛋白（LPS-binding protein,LBP）结合形成LPS受体复合物,募集适配分子MyD88,MyD88的死亡结构域再激活下游的相关激酶,包括NF-κB诱导激酶（NF-κB-inducing kinase NIK）和蛋白激酶C和蛋白酪氨酸激酶（PKC/PTK）,激活的NIK或PKC/PTK都能独自活化IκB激酶（IκB kinase, IKK）复合物,导致IκB磷酸化降解,NF-κB移位入核,启动目的基因转录。研究证实CCK-8对内毒素血症肺组织、LPS诱导肺巨噬细胞NF-кB活性增加有抑制性调节作用。而CCK-8对LPS诱导VSMC活化的信号通路影响鲜有报道。鉴于VSMC是血管的功能细胞,本课题在我室系列研究的基础上,以体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞（thoracic aortic smooth muscle cells, TASMCs）为研究对象,拟观察CCK-8对LPS诱导大鼠TASMCs iNOS和不同类型SOD表达的影响及其信号转导机制,以及CCK-8对LPS诱导大鼠TASMCs阿片受体表达的影响及其在受体水平的交互作用,以进一步探讨CCK-8缓解ES大鼠血管功能障碍的分子机制。1 CCK-8抑制LPS诱导大鼠TASMCs iNOS表达的受体机制研究1. 1 CCK受体在大鼠TASMCs中的表达及LPS的影响目的:为了探讨CCK受体在大鼠TASMCs中的表达及不同剂量及不同时间LPS对CCK受体表达的影响。方法:用贴块法培养大鼠TASMCs,给予LPS （0.1mg/L）孵育细胞不同时间,采用RT-PCR及免疫细胞化学技术检测CCK-AR和CCK-BR的基因和蛋白表达及LPS对其表达的影响。数据用x±s表示,用SPSS统计分析软件进行统计学分析,用ANOVA及LSD进行组间比较及两两比较,P<0.05为有显著性差异。结果:（1） CCK-AR和CCK-BR mRNA及蛋白在大鼠TASMCs中均有表达。CCK-AR mRNA RT-PCR扩增片段为1.37kb,CCK-BR mRNA RT-PCR扩增片段为480bp。以β-actin做内参对照,片段长度为450bp。（2） CCK-AR mRNA平均表达水平（与β-actin的AU比值）:对照组为0.3654±0.132%,LPS组1h、2h、4h、8h分别为0.7172±0.117%、1.7211±0.103%、0.8036±0.175%、1.1315±0.18%,较对照组均有显著增加（P<0.05）,其中2h表达最高（P<0.01）,4h时略有下降,8h又有所回升;CCK-BR mRNA平均表达水平对照组为0.9115±0.106%,LPS组1h, 2h, 4h, 8h分别为1.0424±0.094%、1.9741±0.194%、1.3329±0.062%、1.1599±0.108%,较对照组有显著增加（P<0.05）,其中2h表达最高。且CCK-BR的相对表达量高于CCK-AR（p<0.05）。（3） CCK-AR和CCK-BR均为膜蛋白。免疫细胞化学技术检测结果显示,对照组TASMCs细胞膜及细胞浆有CCK-AR和CCK-BR的阳性表达（阳性率为每十个高倍视野大于5%）,LPS（0.1mg/L）孵育TASMCs 2h,可见2种蛋白表达均上调,其中CCK-BR蛋白表达高于CCK-AR。结论:在体外培养的大鼠TASMCs中存在着CCK-AR和CCK-BR mRNA及蛋白的表达;LPS可诱导其表达上调。1. 2 CCK-8抑制LPS诱导大鼠TASMCs iNOS表达的受体机制目的:前面的实验已证实了大鼠TASMCs有CCK-AR和CCK-BR mRNA及蛋白的表达,且LPS可诱导其表达上调。内毒素休克时,血管平滑肌细胞合成大量诱导型一氧化氮合酶（inducible nitricoxide synthase, iNOS）,从而导致舒血管因子一氧化氮（nitric oxide,NO）超量产生,是ES早期血管舒张、血压降低的重要原因之一。但TASMCs作为ES血管反应的关键效应细胞,CCK-8对其iNOS表达及其受体作用机制有何影响尚未见报道。本部分将主要观察CCK-8对LPS诱导TASMCs iNOS表达及CCK-AR拮抗剂CR-1409和CCK-BR拮抗剂CR-2945对其的影响,以阐明CCK-8的抗休克作用机制。方法:培养大鼠TASMCs,在加入或不加入CCK-8和/或CCK受体拮抗剂CR-1409/CR-2945的情况下,给予LPS刺激细胞16h,用RT-PCR技术检测细胞iNOS mRNA的表达;Western blot技术检测胞浆iNOS蛋白表达,以光密度值表示其相对含量。数据用x±s表示,用SPSS统计分析软件进行统计学分析,用ANOVA及LSD进行组间比较及两两比较,P<0.05为有显著性差异。结果:（1） TASMC自发性产生iNOS的量非常少,低于我们检测的下限。（2） LPS（0.1mg/L）可显著增加TASMCs中iNOS mRNA及蛋白的表达（P<0.01）,分别是对照组的3.81、4.16倍。（3） CCK-8可抑制LPS的这种作用（P<0.01）,且在10^-10、10^-8、10^-6 mol/L浓度呈剂量依赖性。（4）预先给于CCK -AR特异性拮抗剂1409(10^-5 mol/L)、CCK -BR特异性拮抗剂2945(10^-5 mol/L),二者均可部分拮抗CCK-8的这种抑制作用;且预先给予CR-1409后,细胞iNOS基因表达量与CCK-8+LPS组相比升高了52.96%（P<0.01）,蛋白表达量升高了33.7%（P<0.01）;而预先给予CR-2945处理后,iNOS基因表达量与CCK-8+LPS组相比升高了42.16%（P<0.01）,蛋白表达量升高了23.56%（P<0.05）。这说明CR-1409和CR-2945的拮抗作用主要发生在基因水平,而且在相同浓度的CR-1409和CR-2945情况下,CCK-AR特异性拮抗剂CR-1409对CCK-8下调iNOS表达的抑制作用更强,提示在CCK-8该效应中CCK-AR的作用强于CCK-BR。CCK-8、1409、2945单独作用与对照组相比无显著差异（P>0.05）。结论: LPS可增加TASMCs中iNOS mRNA及蛋白的表达;CCK-8抑制了LPS的这种作用; CCK-8的这种抑制作用是由其靶细胞膜上特异性受体介导的,且CCK-AR的作用略强于CCK-BR。2 CCK-8抑制LPS诱导的大鼠TASMCs SOD表达的信号转导机制初探2. 1 PTK通路参与CCK-8对LPS诱导的大鼠TASMCs NF-κB活性的影响目的:NF-κB是内毒素休克过程中重要的转录因子,蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase ,PTK）作为NF-κB的上游蛋白,介导细胞多种不同的信号转导途径。本部分主要研究CCK-8是否影响LPS诱导TASMCs中NF-κB活性变化及PTK是否参与这一过程,以阐明CCK-8的抗休克信号转导机制。方法:培养大鼠TASMCs,在加入或不加入CCK-8和/或PTK特异性拮抗剂Genistein的情况下,用LPS刺激细胞一定时间,用电泳迁移率改变分析（EMSA）方法检测细胞NF-κB活性变化;用Western blot技术分析细胞胞浆中IκB蛋白的表达水平;用免疫细胞化学分析技术观测P65蛋白的核转位。数据用x±s表示,用SPSS统计分析软件进行统计学分析,用ANOVA及LSD进行组间比较及两两比较,P<0.05为有显著性差异。结果:（1）用LPS（0.1mg/L）孵育TASMCs 1h,细胞内NF-κB活性明显高于溶剂对照组（P<0.01）;而CCK-8剂量依赖性地抑制了LPS诱导的NF-κB活性增高,10^-10、10^-8、10^-6 mol/L CCK-8的抑制率分别为27%、66%和80%（P<0.05,P<0.01）;而预先给予Genistein (10^-5 mol/L),NF-κB活性受抑更明显,与LPS组及LPS+CCK-8组相比有显著差异（P<0.05 , P<0.01）;CCK-8及Genistein单独孵育对细胞NF-κB活性无明显影响（P>0.05）。用同源性寡核苷酸（含NF-κB结合位点）及异源性寡核苷酸（含AP-2结合位点）作为竞争物证实了DNA-蛋白结合的特异性。（2）用免疫细胞化学技术检测TASMCs P65蛋白,对照组可见细胞浆呈强阳性表达,即胞浆内有大量棕黄色颗粒,而细胞核表达极弱,用LPS孵育细胞1h,胞浆P65蛋白明显降低（P<0.01）、胞核P65蛋白显著增高（P<0.01）;CCK-8 (10^-10-10^-6 mol/L)预处理可剂量依赖性抑制LPS处理的胞浆P65蛋白水平降低（P<0.01）及核P65蛋白水平增高（P<0.01）;而预先10min加入Genistein,胞浆P65蛋白水平增高及胞核P65蛋白水平降低更显著,与LPS组相比有显著差异（P<0.01）;CCK-8及Genistein单独孵育对P65蛋白水平无明显影响。（3） LPS孵育TASMCs 30 min,IκBα蛋白水平明显降低（P<0.01）; CCK-8（10-8-10-6 mol/L）可增加LPS处理的TASMCs内IκBα蛋白水平（P<0.05）,呈剂量依赖性;而预先给予Genistein(10^-5 mol/L),TASMCs内IκBα蛋白水平增加更明显,与LPS组相比有显著差异（P<0.05）,但与LPS+CCK-8组相比无显著差异（P>0.05）;CCK-8或Genistein单独孵育对细胞IκBα蛋白无明显影响（P>0.05）。结论:CCK-8可抑制LPS诱导的NF-κB活性增加,而PTK参与了这一过程,这可能是CCK-8抗内毒素休克作用的上游信号转导机制之一。2. 2 CCK-8抑制LPS诱导的大鼠TASMCs SOD表达的信号转导机制目的:超氧化物岐化酶（superoxide dismutase, SOD）是机体清除自由基的重要抗氧化酶,可清除超氧阴离子;而内毒素休克的发病早期,体循环血管舒张、平均动脉压进行性降低与氧自由基的生成增多密切相关。我们的研究表明, CCK-8具有一定的抗内毒素休克作用,可增强SOD的活性,翻转LPS导致的SOD活性降低;抑制LPS诱导的Cu-Zn SOD及Mn SOD mRNA表达的增高。本试验第二部分（1）已证实CCK-8可抑制LPS诱导的NF-κB活性增加,且PTK参与了这一过程。然而,CCK-8抑制LPS诱导的大鼠TASMCs SOD表达的的信号转导机制尚未阐明。鉴于NF-кB是参与LPS诱导细胞产生自由基的重要转录因子,为进一步阐明CCK-8抗内毒素休克效应的分子机制,本部分内容主要观察Gen作用于CCK-8和LPS共同孵育的TASMCs后,Cu-Zn SOD及Mn SOD mRNA表达的变化。方法:培养大鼠TASMCs,在加入或不加入CCK-8和/或Genistein的情况下,用LPS刺激细胞一定时间,用半定量RT-PCR检测SOD mRNA表达。数据用x±s表示,用SPSS统计分析软件进行统计学分析,用ANOVA及LSD进行组间比较及两两比较,P<0.05为有显著性差异。结果:（1）对照组TASMCs存在着Mn SOD、Cu-Zn SOD mRNA基础表达;（2）加入LPS处理细胞4h,Mn SOD、Cu-Zn SOD mRNA表达均明显上调,与对照组相比有显著差异（P<0.05）;（3） CCK-8(10^-8mol/L)预先处理30 min、再加入LPS,Mn SOD、Cu-Zn SOD mRNA表达上调可部分抑制,与LPS组相比有显著差异（P<0.01）;CCK-8或Genistein单独处理,Mn SOD、Cu-Zn SOD mRNA表达明显下调,与对照组有显著差异（P<0.05）;（4）预先10min加入Genistein,则Mn SOD、Cu-Zn SOD mRNA表达受抑更明显,与LPS组相比有显著差异（P<0.01）,但与LPS+CCK组相比无显著差异（P>0.05）。结论:CCK-8可抑制LPS诱导的Cu-Zn SOD及Mn SOD mRNA表达的增高,且PTK介导了这一过程,这可能是CCK-8抗内毒素休克作用的信号转导机制之一。3 CCK-8对LPS诱导的大鼠TASMCs阿片受体表达的分子机制3. 1 CCK-8及其受体对LPS诱导大鼠TASMCs阿片受体表达的影响目的:阿片受体存在多种亚型,包括μ、κ、δ、σ、ε、λ、ζ等7种,广泛分布于神经及其它系统,通过与阿片肽相互作用,介导许多生理、病理活动。已有报道动物与人的血管壁上存在阿片受体;阿片受体可参与失血性休克;非特异性阿片受体阻断剂naloxone具有抗内毒素休克作用。但TASMCs是否存在κ阿片受体?CCK-8对其表达的影响如何尚未明了。本部分内容主要观察CCK-8、CR-1409和CR-2945、κ阿片受体特异性拮抗剂Nor-BNI作用于LPS孵育的TASMCs后,κ阿片受体mRNA表达的变化,以阐明κ阿片受体在内毒素休克中的作用。方法:培养大鼠TASMCs,在加入或不加入CCK-8和/或CR-1409和CR-2945、Nor-BNI的情况下,用LPS刺激细胞16h,用半定量RT-PCR检测κ阿片受体mRNA的表达。数据用x±s表示,用SPSS统计分析软件进行统计学分析,用ANOVA及LSD进行组间比较及两两比较,P<0.05为有显著性差异。结果:（1）对照组TASMCs存在着κ阿片受体mRNA的基础表达;（2）加入LPS处理细胞,κ阿片受体mRNA表达明显上调,与对照组相比有显著差异（P<0.01）;（3） CCK-8(10^-6、10^-8、10^-10mol/L)预先处理30 min、再加入LPS,κ阿片受体mRNA表达上调可部分抑制,并呈剂量依赖性,与LPS组相比有显著差异（P<0.05）;（4）预先10min加入Nor-BNI,再给予LPS和CCK-8,κ阿片受体mRNA表达受抑更明显,与LPS组及LPS+CCK组相比有显著差异（P<0.05）;（5）预先10min加入CR-1409、CR-2945,再给予LPS和CCK-8,κ阿片受体mRNA表达受抑均有所增加;其中LPS+CCK+CR-2945组与LPS+CCK组相比有显著差异（P<0.05）,但LPS+CCK+CR-1409组与LPS+CCK组相比无显著差异（P>0.05）;（6） CCK-8、CR-1409和CR-2945、Nor-BNI单独处理,κ阿片受体mRNA表达均轻微上调,但与对照组无显著差异。结论:CCK-8通过其受体抑制了LPS诱导的TASMCsκ阿片受体mRNA表达的增高,说明内毒素休克过程中,CCK-8与阿片受体之间在基因水平有交互作用,这可能也是CCK-8抗内毒素休克作用的机制之一。3. 2 CCK-8对LPS诱导的大鼠TASMCs阿片受体表达的分子机制目的:蛋白激酶C （protein kinase C, PKC）是一个由十多个成员组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,广泛分布于多种组织、器官和细胞中,对细胞的生长、代谢、增殖和分化起着重要的调节作用。我们前面的实验已证实,CCK-8可通过其受体抑制LPS诱导的κ阿片受体mRNA表达增加,但其作用的信号转导机制还未完全明了。本部分内容主要观察PKC拮抗剂白屈菜赤碱（chelerythrine, CHE）、吗啡作用于CCK-8和/或LPS孵育的TASMCs后κ阿片受体mRNA表达变化,以阐明CCK-8调节LPS诱导大鼠TASMCsκ阿片受体表达的分子机制。方法:培养大鼠TASMCs,在加入或不加入CCK-8和/或CHE、吗啡的情况下,用LPS刺激细胞16h,用半定量RT-PCR检测κ阿片受体mRNA的表达。数据用x±s表示,用SPSS统计分析软件进行统计学分析,用ANOVA及LSD进行组间比较及两两比较,P<0.05为有显著性差异。结果:（1）预先10min加入CHE,再给予LPS和CCK-8,则κ阿片受体mRNA表达受抑更明显,与LPS组及LPS+CCK组相比均有显著差异（P<0.01,P<0.05）;（2）预先10min加入吗啡,再给予CCK-8,则κ阿片受体mRNA表达增加部分受抑,与吗啡组相比有显著差异（P<0.05）;而再加入LPS,κ阿片受体mRNA表达增加受抑有所缓解,与LPS+CCK组及CCK+吗啡组相比均有显著差异（P<0.05）;（3） CHE单独处理,κ阿片受体mRNA表达均轻微上调,但与对照组无显著差异;吗啡单独处理,κ阿片受体mRNA表达明显上调,与对照组相比有显著差异（P<0.01）。结论:CCK-8可通过PKC抑制LPS诱导大鼠TASMCsκ阿片受体mRNA表达的增高,这可能是CCK-8抗内毒素休克作用的信号转导机制之一。小结本研究从受体、转录因子、与ES相关因子的基因及蛋白表达多个层次比较系统地研究了CCK-8对LPS诱导TASMCs的调节作用及其信号转导机制,取得以下新发现:1. CCK-AR和CCK-BR在大鼠TASMCs中均有表达;LPS可明显诱导其表达上调,其中CCK-BR的相对表达量高于CCK-AR。2. CCK-8可剂量依赖性地抑制LPS引起大鼠TASMCs iNOS表达的增加,此作用是由其受体介导的。3. CCK-8对LPS诱导大鼠TASMCs NF-κB的活化抑制作用,且PTK参与了此过程。4. CCK-8可抑制LPS诱导大鼠TASMCs的Cu-ZnSOD、MnSOD mRNA表达,LPS-PTK-NF-κB-SOD通路可能是其信号转导之一。5. CCK-8可抑制LPS诱导大鼠TASMCs阿片受体基因表达的增高,且由CCK受体介导,说明内毒素休克过程中,CCK-8与阿片受体之间在基因水平有交互作用,且PKC参与了此过程。