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糖尿病足溃疡病因复杂,患者因长期高血糖发生血管病变、神经病变等并发症或合并感染,导致足溃疡创面难愈,治疗效果不佳,具有较高的致残甚至致死率。太子参多糖是太子参中具有生物活性的一类大分子物质,具有降血糖、改善糖耐量、保湿、皮肤组织修复等作用,同时可提供湿性封闭环境加速创面愈合。干细胞移植能够促进各种细胞因子分泌、靶向受损组织器官、修复微循环、重建组织细胞功能等作用,骨髓间充质干细胞具有自我更新、低免疫原性及多向分化潜能等特性,为各种组织损伤性疾病的治疗提供了一种新的技术手段。本研究以太子参多糖外敷、多糖内服外用两种给药模式,干细胞移植、太子参多糖外敷联合大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)移植协同治疗,提高糖尿病足溃疡愈合的疗效;并探讨太子参多糖及其联合BM-MSCs移植治疗大鼠糖尿病足溃疡可能的作用机制。为太子参新药产品的研发、促进干细胞的临床应用奠定基础。第一章太子参多糖制备采用水提醇沉法制备太子参多糖,制得太子参多糖492.50g,得率为9.85%;所得太子参多糖为黄白色粉末。采用苯酚-硫酸法测定太子参多糖含量平均值为43.60%。应用层析柱凝胶色谱法测定太子参多糖相对分子量分布范围为3.0×10~3~2.1×10~5 Da。第二章太子参多糖及其联合BM-MSCs移植治疗大鼠糖尿病足溃疡药效学研究2.1实验动物与干细胞通过腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)40mg/kg制备大鼠高血糖模型,注射72h后,连续3天监测空腹血糖值≥16.7mmol/L为高血糖模型成功大鼠;并在此基础上,采用足部全层皮肤切除法,制备大鼠糖尿病足溃疡模型。空白对照大鼠血糖正常,进行足部皮肤切除术。全骨髓贴壁法体外培养BM-MSCs至第3代,经DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)荧光标记,MTT法检测细胞生长活力。2.2太子参多糖(PHP)外敷治疗大鼠糖尿病足溃疡呈量效及时效关系考察48只SPF级雄性Wistar大鼠随机分为6组,每组8只。分别为空白组,模型组,金因肽阳性对照组(重组人表皮细胞生长因子外用溶液);太子参多糖高、中、低剂量组(PHP-HD、PHP-MD、PHP-LD),0.30、0.20、0.14g/mL每日两次,局部用药1mL。分别于给药后7、14天监测大鼠空腹血糖,对足溃疡创面拍照,采用ImageJ软件进行图像分析,测量创面面积并计算创面愈合率;确定太子参多糖外用给药的最佳剂量和疗程。实验周期内,空白对照组大鼠血糖均处于正常水平(4.25±0.48~4.53±0.48),高血糖模型大鼠血糖一直维持在较高水平(19.20±4.90~29.70±3.81);P<0.01,差异具有显著的统计学意义,说明高血糖大鼠造模成功;外用金因肽和太子参多糖并不能降低高血糖大鼠血糖值,同时高血糖大鼠血糖也无自然恢复。与模型组比较,空白组的正常动物创面结痂和愈合速度明显快于糖尿病动物(P<0.01),表明高血糖影响大鼠足溃疡创面的愈合。给药14天,与模型组(47.06%±0.23)相比,PHP-MD组(92.10%±0.10)溃疡面愈合较快,P<0.01,差异有显著统计学意义;PHP-LD组(82.39%±0.09)、PHP-HD组(69.99%±0.12)次之。且PHP-MD组创面愈合率与阳性组相差不大(P>0.05)。得0.20g/mL太子参多糖外用(PHP-MD)大鼠足溃疡创面愈合效果最佳,给药疗程为14天左右2.3太子参多糖联合BM-MSCs移植治疗大鼠糖尿病足溃疡药效学实验96只SPF级雄性Wistar大鼠随机分为9组,分别为空白组、模型组、金因肽阳性对照组、二甲双胍+PHP-MD组(二甲双胍150mg/kg灌胃及太子参多糖中剂量外用)、PHP-MD组、PHP-MD口服+外用组(中剂量太子参多糖500mg/kg灌胃及外用)、BM-MSCs组(BM-MSCs移植)、联合组(BM-MSCs移植及太子参多糖中剂量外用)、PBS组(PBS注射)。给药周期内,各给药组大鼠血糖一直维持在19.64±3.46~31.98±2.65较高水平,与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);即BM-MSCs移植同外用金因肽和太子参多糖并不能降低高血糖大鼠血糖值,同时高血糖大鼠血糖值也无自然恢复。二甲双胍+PHP-MD组,血糖平均值分别为10.21±2.43和11.08±1.39,均处于较低水平;与模型对照组血糖值相比,差异均具有显著统计学意义(P<0.01),PHP-MD组与模型组血糖比较差别不大,且无统计学意义(P>0.05)。PHP-MD口服+外用组血糖平均值高于二甲双胍+PHP-MD组,但一直呈下降趋势,且14day时与模型组血糖平均值相比具有显著的统计学差异(P<0.01);说明太子参多糖口服具有一定的降血糖作用,口服二甲双胍具有显著的降糖作用。给药14天,PHP-MD组、PHP-MD口服+外用组、BM-MSCs组、联合组(91.40%±0.17~94.77%±0.06)创面结痂和愈合速度明显快于模型组,与模型组(28.97%±0.12)相比,差异具有显著统计学意义(P<0.01);与阳性组(88.35%±0.12)比较,创面愈合率差异无统计学意义(P?0.05)。说明太子参多糖外用、多糖口服+外用,BM-MSCs移植、多糖外用联合BM-MSCs移植均具有促进高血糖大鼠足溃疡创面愈合的药效;其中联合组创面愈合速度较快(93.43%±0.08),表明多糖外用联合BM-MSCs移植可产生协同作用,以提高治疗大鼠糖尿病足溃疡的疗效。第三章太子参多糖及其联合BM-MSCs移植治疗大鼠糖尿病足溃疡机制研究3.1组织病理学研究采用HE染色法观察各组溃疡创面形态学变化,对比分析各组创面组织修复情况。CD31免疫组化,检测各组创面阳性微血管数目,评估创面组织血管生成情况。HE染色结果显示,给药14天,除模型组、PBS组外,各给药组及空白组表皮结构连续完整,毛细血管与毛囊较多新生,其中以联合组新生毛囊数为最多。提示太子参多糖联合BM-MSCs移植可能通过推进创面上皮化过程,促进大鼠糖尿病足溃疡面组织新生。CD31免疫组化显示,给药14天,各给药组创面微血管密度相差不大;其中联合组平均阳性微血管数目(15.97±3.58)多于BM-MSCs组、PHP-MD口服+外用组、PHP-MD组(15.37±3.56~15.94±4.17),与模型组、PBS组(11.08±3.23~11.75±3.64)比较有显著差异(P<0.01)。提示多糖外用联合BM-MSCs移植促进大鼠糖尿病足溃疡的愈合可能与促进溃疡面微血管的新生有关。3.2各组大鼠糖尿病足溃疡组织VEGF mRNA的表达采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测大鼠溃疡局部血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达。给药后第14天,各给药组大鼠足溃疡创面局部VEGF mRNA相对表达量(1.03±0.38~2.08±0.17)与模型组(0.66±0.05)相比均较高,且差异具有统计学意义(P<0.01)。这一结果提示大鼠体内高血糖抑制溃疡创面VEGF mRNA表达,导致糖尿病足溃疡难以愈合;太子参多糖联合BMMSCs移植促进高血糖大鼠足溃疡创面的愈合作用可能是通过增强溃疡创面VEGF mRNA的表达,促进创面血管生成,提高创面血供、血氧及组织温度,达到促进糖尿病足溃疡创面愈合的效果。综上本研究采用太子参多糖外敷、太子参多糖外敷及口服两种给药模式,干细胞移植及太子参多糖外敷联合干细胞移植协同治疗;发挥多糖外敷“湿性封闭组织创面”特性、口服多糖降血糖药理作用协同间充质干细胞移植后自我更新、多向分化和免疫调节的特点;有效提高大鼠糖尿病足溃疡创面的修复。其作用机制可能是通过提高足溃疡面VEGF的表达,使得组织血管新生及上皮化过程的推进,促进大鼠糖尿病足溃疡创面的愈合。