研究背景糖尿病视网膜病变是糖尿病患者最重要的微血管并发症之一,也是成人主要的致盲眼病,其早期特征是视网膜微血管周细胞的凋亡,血管渗透性增加,进行性的血管闭塞,然而引起这些改变的详细机制仍然不清楚。血视网膜内屏障(inner blood retinal barrier, iBRB)是由视网膜血管内皮细胞、覆盖内皮细胞的周细胞及基底膜所构成。iBRB的完整性是由紧密连接和黏附连接构成密封的连接复合体所决定,另外一个决定因素是肌动蛋白细胞骨架。细胞-细胞和细胞-细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)的黏附连接主要由钙粘蛋白(cadherin)和通过构象改变来完成结构和信号分子激活的整合蛋白(integrin)所介导。在视网膜,介导内皮细胞之间同源性黏附连接的cadherin主要是VE-cadherin和N-cadherin,形成局部黏附。而介导内皮细胞和周细胞之间异源性黏附主要是N-cadherin,形成特殊的钉铆结构的黏附连接。N-Cadherin通过β-连环蛋白(β-catenin)连接到肌动蛋白细胞骨架。而内皮细胞、周细胞与ECM的连接主要是整合蛋白所介导。整合蛋白介导细胞黏附经信号分子募集到局部黏附来调控大量生物学过程,包括调控细胞生长、移动、分化、凋亡、细胞生存以及跨膜信号转导的激活。一个在整合蛋白激活和信号转导中起关键作用的激酶是整合蛋白连接激酶(integrin-linked kinase, ILK )。ILK是细胞内包含丝氨酸-苏氨酸激酶的锚蛋白重复序列,与β1,β3-整合蛋白相互作用,作为细胞反应整合蛋白和生长因子所介导的信号的关键调控子调控整合蛋白依赖的功能。ILK涉及细胞骨架的构成、细胞增殖、生存和凋亡以及ECM的聚集。ILK连接整合蛋白到肌动蛋白细胞骨架,转导从整合蛋白到细胞外基质和各种亚细胞成分的信号以及从细胞外环境到细胞内的信号。同样,ILK调控一些信号中间媒介活性,包括Akt/FOXO、GSK-3β、ERK、β-catenin和cadherin。然而目前还没有关于ILK及其相关信号分子在糖尿病视网膜病变中生物学功能的研究。本研究的目的是证明ILK以及FOXO1A、N-cadherin和β-catenin在链唑霉素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠视网膜和高糖诱导的牛视网膜微血管周细胞的表达及其在糖尿病视网膜病变发展的影响作用,阐明ILK对糖尿病视网膜病变进展的可能的调控作用,进一步探索预防糖尿病视网膜病变的线索,开辟治疗糖尿病视网膜病变的新途径。目的1.本研究通过分析ILK在STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜及视网膜微血管中的活性和表达,证明ILK是否涉及糖尿病视网膜病变的发病机理。2.通过研究N-cadherin,β-catenin和FOXO1A在糖尿病大鼠视网膜及视网膜微血管中的表达,证明其是否影响糖尿病视网膜病变的发展。3.通过研究ILK和FOXO1A在高糖条件下培养的牛视网膜微血管周细胞的表达证明ILK和FOXO1A是否涉及高糖诱导的周细胞凋亡。方法该课题研究通过建立STZ诱导的糖尿病大鼠模型和原代培养牛视网膜微血管周细胞,采用伊文思蓝的方法测量对照组和STZ诱导的糖尿病大鼠4w、8w和12w视网膜微血管渗透性,半定量RT-PCR检测对照组和STZ诱导的糖尿病大鼠4w、8w和12w视网膜ILK mRNA水平,免疫组化检测对照组和STZ诱导的糖尿病大鼠12w视网膜及视网膜微血管ILK、N-cadherin、β-catenin和FOXO1A的免疫反应性,进一步采用Western blot方法检测对照组和STZ诱导的糖尿病大鼠4w、8w和12w视网膜ILK、N-cadherin、β-catenin、Akt和FOXO1A的蛋白水质表达水平;免疫细胞化学检测高糖条件下培养72h的牛视网膜微血管周细胞ILK和FOXO1A免疫染色,Annexin V-FITC流式细胞仪检测高糖诱导的视网膜微血管周细胞凋亡水平。Western blot方法检测高糖条件下培养24 h、48 h和72 h牛视网膜微血管周细胞ILK和FOXO1A的蛋白质水平。结果1.STZ诱导的糖尿病大鼠体重与对照组相比显著减轻(P<0.005),12 w糖尿病大鼠体重236±14.1 g,而对照组大鼠体重为496±10.2 g。同时,STZ诱导的糖尿病大鼠血糖水平与对照组相比显著升高(P <0.005),糖尿病诱导后12 w血糖为30.2±4.8 mmol/L,对照组血糖为4.9±0.12 mmol/L。2.STZ诱导的糖尿病大鼠4 w、8 w和12 w后,视网膜血管渗透性与对照组相比分别增加68%、91%和125% (P <0.005)。3.半定量RT-PCR结果分析表明STZ诱导的糖尿病大鼠4 w、8 w和12 w后,视网膜ILKmRNA水平与对照组相比分别增加12.2%、35.8%和45.6% (P <0.05)。4.免疫组织化学结果分析表明,视网膜ILK免疫染色主要分布在OPL、INL、IPL、GCL及视网膜微血管包括内皮细胞和周细胞,而STZ诱导的糖尿病大鼠12 w后,ILK免疫反应性显著增加。同样FOXO1A免疫染色主要分布在OPL、INL、IPL、GCL及视网膜微血管包括内皮细胞和周细胞,而STZ诱导的糖尿病大鼠12 w后,FOXO1A免疫反应性显著增加;β-catenin的免疫染色主要分布在大鼠视网膜PL、OPL、IPL、GCL、ILM及视网膜微血管包括内皮细胞和周细胞,而STZ诱导的糖尿病大鼠12 w后,β-catenin的免疫反应性显著增强;N-cadherin的免疫染色主要分布在视网膜OPL、INL、IPL、GCL、ILM及视网膜微血管包括内皮细胞和周细胞,但是STZ诱导的糖尿病大鼠12 w后,N-cadherin的免疫反应性显著减少。5.Western blot结果分析表明STZ诱导的糖尿病大鼠4 w、8 w和12 w后,视网膜ILK蛋白质水平与对照组相比分别增加35.6%、77.6%和89.8%( P <0.05),同样β-catenin蛋白质表达水平与对照组相比分别增加13. 2%、15.8%和35.1%(P <0.05),而N-cadherin蛋白质水平与对照组相比分别减少15.4%、28.37%和37.2%(P <0.05);与此同时STZ诱导的糖尿病大鼠8 w和12 w后,视网膜Akt蛋白质水平与对照组相比分别减少15.2%和22.1%( P <0.05),磷酸化Akt-473和Akt-308蛋白质水平分别减少38.5%、65.4%和8.8%、63.4%( P <0.05),同样FOXO1A和磷酸化FOXO1A蛋白质水平分别增加20.2%、41.6%(P <0.05)和减少5.8%、25.8%(P <0.05);而在糖尿病大鼠诱导后4 w,视网膜Akt蛋白质水平增加20.6% (P <0.05),磷酸化Akt-473和Akt-308蛋白质水平分别增加136.6%和64.8%( P <0.05),而视网膜FOXO1A和磷酸化FOXO1A蛋白质水平分别减少23.2%(P <0.05)和增加55.8%(P <0.05)。6.免疫细胞化学发现牛视网膜微血管周细胞在5mmol/L D-葡萄糖条件下培养72 h后未发现ILK免疫染色,而FOXO1A免疫染色主要分布在细胞核和细胞质;在30 mmol/L D-葡萄糖或5μmol/L H2O2条件下培养72 h后,周细胞形态发生改变,ILK免疫反应性显著增强,免疫染色主要分布在细胞质,同样FOXO1A免疫反应性显着增加,FOXO1A免疫染色主要分布在细胞核和细胞质。7.流式细胞仪检测发现周细胞在30 mmol/L高糖条件下培养24 h、48 h和72 h后凋亡与对照组相比分别增加47.6%、58.4%和68.7%( P <0.05)具有时间依赖性。8.Western blot检测发现周细胞在30 mmol/L D-葡萄糖条件下培养24 h、48 h和72 h, ILK的蛋白质水平与对照组相比分别增加27.2%、48.6%和54.5%( P <0.05),对照组和甘露醇组无显著差别;周细胞在高糖条件下培养24 h, FOXO1A和p-FOXO1A的蛋白质水平与对照组相比分别减少17%和增加40% (P <0.05),培养48 h和72 h后FOXO1A和p-FOXO1A的蛋白质水平与对照组相比分别增加45%、51%(P <0.05)和减少44%、63% (P <0.05)。而甘露醇组与对照组无显著差别。结论1.本研究首次证明STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜及视网膜微血管ILKmRNA和蛋白质表达上调,表明ILK可能参与早期糖尿病视网膜神经和血管组织的损害以及糖尿病视网膜病变的进展。2.本研究首次证明STZ诱导糖尿病大鼠视网膜及其微血管N-cadherin表达下调,而β-catenin和FOXO1A表达上调,说明高血糖对视网膜N-cadherin、β-catenin和FOXO1A具有影响作用,同样也说明这些蛋白质表达的改变可能涉及早期糖尿病视网膜的损害。3.本研究结果首次证明高糖诱导的牛视网膜微血管周细胞ILK和FOXO1A表达显著增加,说明高糖诱导的牛视网膜微血管周细胞ILK和FOXO1A表达上调可能与凋亡有关。