原癌基因和抑癌基因共同调控细胞的增殖和凋亡,本研究证实肿瘤抑制基因p53拮抗另一个肿瘤抑制基因RASSF1A(RAS相关区域家族蛋白1A),通过作用于RASSF1A启动子抑制其表达。p53对RASSF1A的抑制调控了细胞凋亡。Intersex是中介体复合物的一个新亚基,同RASSF1A一样可与微管蛋白α-tubulin结合。蛋白互作研究表明RASSF1A可与Intersex蛋白相互作用。而且,RASSF1A与Intersex的相互作用引起Intersex蛋白在癌症细胞内的弥散,表明RASSF1A可发挥交通工具的作用沿着微管来运输Intersex蛋白。此外,我们还发现RASSF1A启动子区的CG岛具有最高启动活性并且在睾丸癌病人中发生了高甲基化。RASSF1A启动子的高甲基化导致了肿瘤病人RASSF1A的表达沉默。我们在睾丸肿瘤的组织芯片中发现p53、RASSF1A和Intersex三种蛋白具有共定位及定位变化特征,进一步揭示了p53-RASSF1A-Intersex之间的相互作用。这些结果提示p53可通过与RASSF1A之间的互作关系及RASSF1A-Intersex通路调控癌症的发展。我们的研究为认识肿瘤抑制基因之间的拮抗提供了一个新的起点。1. RASSF1A基因启动子在睾丸肿瘤中发生高甲基化,导致表达降低生殖系统肿瘤是严重危害生命健康,降低人类生活质量的常见恶性肿瘤,而睾丸癌是年轻男性最常见的恶性肿瘤,病死率高,预后很差。RASSF1A基因的表达失活与肿瘤的发生发展密切相关。最近研究证实RASSF1A在人类肿瘤包括生殖系统肿瘤中很少突变,启动子高甲基化是RASSF1A表达失活的主要机制。为了研究RASSF1A启动子在睾丸癌中是否发生了高甲基化及其对表达的影响,我们对RASSF1A启动子进行了分析。克隆了不同长度的RASSF1Apro-EGFP载体,通过细胞转染和流式细胞术,证实距ATG(+1)上游301bp的部分具有最高启动活性,并对这一区域进行了甲基化岛分析,通过甲基化特异性PCR(MSP)技术,证实了在睾丸肿瘤中RASSF1A启动子发生了高甲基化,测序结果进一步证实了高甲基化状态并分析了所包括的16个CpG位点的具体甲基化状况。进一步通过免疫组织化学技术,检测到RASSF1A启动子的甲基化导致了其在睾丸癌中的表达降低,说明RASSF1A肿瘤抑制基因的甲基化失活对肿瘤的发生具有重要意义。2.p53蛋白结合到RASSF1A启动子并下调其表达我们预测到在RASSF1A启动子的-2781处存在p53的结合位点。通过构建p53的原核表达载体,原核表达并纯化该蛋白,Gel-shift和电泳迁移率变动试验(EMSA)结果显示p53可以结合到RASSF1A的靶位点。p53和RASSF1A pro-EGFP瞬时共转Cos7细胞显示p53可显著降低EGFP表达。将p53瞬时转染内源表达RASSF1A的Siha细胞,Western blot结果显示RASSF1A表达明显降低。以上结果说明p53可以结合到RASSF1A启动子区域并下调其表达。3. HPV16-E6 RNAi通过p53下调RASSF1A表达HPV感染是睾丸癌、宫颈癌、前列腺癌等生殖系统肿瘤的最大易感因素,其中,高危型HPV16和HPV18更是在生殖系统肿瘤的发生、进展和迁移中起着重要作用。HPV16和HPV18主要编码E6和E7原癌蛋白,通过p53和Rb参与肿瘤发生。E6与p53结合后使之降解失活,破坏了p53介导的细胞对DNA损伤的反应,抑制了细胞周期G1/S节点,同时也抑制p53介导的细胞凋亡。HPV16-E6与RASSF1A之间是否存在联系一直没有明确。通过构建HPV16-E6RNAi载体,瞬时转染HPV16表达细胞Siha, Western blot和实时荧光定量PCR(real-time PCR)显示HPV16-E6表达显著降低,p53表达升高,RASSF1A表达降低。结果表明HPV16-E6可以通过p53调节RASSF1A表达。4.p53诱导细胞凋亡改变,并通过RASSF1A进行负调控p53和RASSF1A均是肿瘤抑制基因,p53与RASSF1A相互作用并下调后者表达引发一个有趣的问题：如果将p53超表达到RASSF1A内源表达细胞后会引起怎样的生物学效应?基于此,我们转染RASSF1A、p53和RASSF1A-siRNA入Siha细胞进行凋亡分析。流式结果显示：RASSF1A-siRNA可以抑制凋亡,单转RASSF1A和p53时凋亡明显增加,共转RASSF1A和p53与单转p53相比凋亡并未明显升高。结果表明,RASSF1A和p53可以引起明显的凋亡,但由于RASSF1A水平的降低,由其引发的凋亡效应降低,负反馈调节由p53引发的生物学功能,使细胞不至于过度死亡而维持相对稳定。5. RASSF1A与Intersex相互作用并参与Intersex蛋白运输我们发现RASSF1A与Intersex基因相互作用并参与其蛋白运输功能。构建了Intersex-dsRED载体并与RASSF1A-EGFP共转染Cos7细胞,共聚焦荧光显微镜显示Intersex的定位发生了明显改变。单转时位于细胞核膜胞质面,呈聚集状态,而与RASSF1A共转后则弥漫性分布于胞浆。免疫共沉淀技术证实Intersex与RASSF1A之间存在相互作用。进一步发现Intersex可与a-tubulin共定位于微管,免疫共沉淀证实了这种相互作用,破坏微管后Intersex的蛋白运输受到抑制,提示RASSF1A的微管结合和稳定功能参与了Intersex的蛋白运输。6. HPV16-E6-p53-RASSFIA-Intersex综合以上结果,我们证实在生殖系统肿瘤中存在这样一条调控凋亡的通路：p53-RASSF1A-Intersex。p53作用于RASSF1A并下调后者表达,共同调控细胞的凋亡,HPV16-E6促发肿瘤的机制可能是通过p53参与此通路,RASSF1A与Intersex、α-tubulin共定位于微管,相互作用并参与Intersex蛋白运输,p53通过与RASSF1A启动子结合来参与此通路,并最终调控凋亡。