背景和目的口腔癌是发生在头颈部最常见的恶性肿瘤之一,包括舌癌、颊癌、牙龈癌、腭癌等,其中90%以上的病例为鳞状细胞癌。在中国,口腔癌的发病率在恶性肿瘤中的占比约1.5%~5.6%,五年生存率约为50%,颈淋巴转移和局部复发是影响其预后最重要的两大因素。CLIC1是氯离子通道蛋白家族成员之一,位于人类染色体6p21.3位点上,其存在形式包括可溶性单体蛋白,可溶性二聚体蛋白寡糖膜结合蛋白和膜蛋白,CLIC1在脂质双分子层中起着离子通道的作用。另一方面,CLIC1作为氧化应激过程的感受器与效应器可参与调节细胞内氧化调节,与神经变性疾病(如阿尔兹海默症)相关。此外,近年来的研究发现氯离子通道在肿瘤的发展进程中发挥重要作用,CLIC1与多种恶性肿瘤的增殖、转移、化疗耐药相关,且CLIC1在不同肿瘤疾病的进程中所起到的作用也是不尽相同的。本课题组的前期研究发现,CLIC1在口腔鳞癌患者的病理标本和血浆中显著高表达,并且CLIC1的表达水平与肿瘤大小、TNM分期、组织病理学分级以及术后生存率等因素具有明显相关性。为进一步探究CLIC1与口腔鳞癌发展之间的关系,本研究聚焦CLIC1对体外OSCC细胞生物学行为的影响,并对其中涉及到的分子机制进行初步探讨。方法1.本实验利用靶向CLIC1的慢病毒转染人口腔鳞状细胞癌细胞株(SCC-15),通过抗生素筛选构建CLIC1低表达、过表达及空载SCC-15细胞系。利用western blot和RT-PCR实验验证转染效果。随后通过CCK-8检测法(细胞增殖实验/顺铂细胞毒性实验)、细胞集落形成实验、流式细胞术(Alexa Fluor 647/PI双染法)、划痕实验和Transwell细胞侵袭、迁移实验和条件培养基作用下脐静脉内皮细胞成管实验来研究CLIC1对人口腔鳞癌细胞的增殖、生存、顺铂药物敏感性、凋亡、迁移和侵袭能力以及诱导血管内皮细胞成管能力的影响。2.通过在裸鼠背部皮下注射不同CLIC1表达水平的SCC-15细胞来构建裸鼠皮下移植瘤模型。对移植瘤的生长和瘤体大小进行观察比较,以分析CLIC1对口腔鳞癌体内生长的影响。HE染色明确肿瘤类型以及有无肝、肾脏器转移。利用western blot检测不同CLIC1表达水平的移植瘤体组织CLIC1、磷酸化ERK1/2、磷酸化p38蛋白的表达水平。免疫组织化学实验对比检测不同CLIC1表达水平的瘤体组织的CLIC1、磷酸化ERK、磷酸化p38、MMP2、MMP9、MMP13的表达情况。3.采用GeneMANIA基因相互关系预测检索整合素蛋白家族(ITGαv,ITGβ1)与CLIC1以及MAPK1之间的关系,western blot和RT-PCR实验分析CLIC1的表达调节对人口腔鳞癌细胞内的ITGαv,ITGβ1,凋亡相关蛋白caspase3、caspase9,侵袭相关蛋白MMP2、MMP9、E-cadherin、vitmentin,MAPK信号通路蛋白ERK1/2、p38以及磷酸化ERK1/2、p38表达水平的影响。结合不同CLIC1表达水平下SCC-15细胞凋亡水平、迁移及侵袭能力的变化,综合分析Integrins/MAPK信号通路在CLIC1调节口腔鳞癌细胞相关生物学行为中可能的信号机制。结果1.通过细胞免疫荧光、Western blot和RT-PCR实验发现,通过靶向CLIC1的慢病毒转染SCC-15细胞后,细胞内的CLIC1表达呈现不同水平,且差异有统计学意义。CLIC1的亚细胞定位主要包括细胞核、核膜、细胞浆、细胞膜。进一步实验发现,SCC-15细胞中的CLIC1表达被抑制后,SCC-15细胞的增殖、侵袭、迁移和促血管生成能力均明显减弱,细胞凋亡水平和对顺铂的药物敏感性均提高。相反,CLIC1表达上调促进了细胞增殖,侵袭和迁移以及促血管生成能力。2.将转染完成的不同CLIC1表达水平的SCC-15细胞注射至裸鼠背部后局部形成肉眼可见的移植瘤,瘤体体积随时间不断增大。一月后解剖瘤体,HE染色确定了瘤体为鳞状细胞癌,表明移植瘤动物模型构建成功。通过对比分析不同CLIC1表达水平的裸鼠移植瘤的生长速度、体积和重量,我们发现CLIC1过表达促进口腔鳞癌的体内生长,CLIC1表达干扰却抑制其生长。免疫组化实验和Western blot分析各组瘤体组织中CLIC1、p-ERK、p-p38、MMP2、MMP9、MMP13的表达情况。我们发现CLIC1低表达的瘤体磷酸化ERK表达明显减少,磷酸化p38表达明显增加,免疫组化染色发现磷酸化ERK、MMP2、MMP9和MMP13表达也减少;而CLIC1过表达组瘤体组织的p-ERK表达明显增加,p-p38表达减少,免疫组化染色中MMP2、MMP9和MMP13蛋白表达增加。表明CLIC1可以影响口腔鳞癌的体内生长,同时CLIC1的表达改变会影响鳞癌组织中p-ERK、p-p38、MMP2、MMP9和MMP13的表达,CLIC1参与口腔鳞癌体内生长可能与MAPK信号通路相关。3.GeneMANIA预测发现整合素蛋白ITGαv、ITGβ1、CLIC1以及MAPK之间存在明显基因相关性。Western blot和RT-PCR实验结果表明,下调SCC-15细胞内的CLIC1表达后,ITGαv、ITGβ1表达下降,磷酸化ERK表达也明显下降,EMT相关蛋白MMP2、MMP9、vimentin表达下降,而E-cadherin、磷酸化p38以及凋亡相关蛋白caspase3、caspase9表达增加;与之相反,CLIC1过表达的SCC-15细胞中ITGαv、ITGβ1表达增加,磷酸化ERK表达也提升,而下游蛋白MMP2、MMP9、vimentin表达提升,E-cadherin减少。RT-PCR分析CLIC1、MMP2、MMP9、caspase3和caspase9的结果WB实验的趋势一致。结合不同CLIC1表达水平下SCC-15细胞的侵袭、迁移能力变化趋势和凋亡水平改变,我们认为CLIC1可能通过ITGs/ERK和ITGs/p38参与调节口腔鳞癌细胞的侵袭和凋亡。结论1.体外研究CLIC1可显著促进人口腔鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移以及诱导血管内皮细胞成管的能力,降低CLIC1表达可促进口腔鳞癌细胞凋亡,并提高癌细胞对顺铂的敏感性。2.体内动物实验证实CLIC1可以促进口腔鳞癌生长。同时,CLIC1的表达调节会引起肿瘤组织内p-EKR、p-p38、MMPs蛋白的表达改变,且磷酸化ERK的表达水平与肿瘤生长变化差异具有一致性,我们认为CLIC1可能会通过MAPK信号途径可能参与口腔鳞癌的生长过程。3.CLIC1在口腔鳞癌细胞中的表达增加,会上调ITGαv和ITGβ1表达,从而引发MAPK/ERK信号通路的激活,通过调节EMT相关蛋白MMP2/MMP9/vimentin和E-cadherin的表达促进细胞侵袭和迁移。类似的,CLIC1在口腔鳞癌细胞中的表达下调会明显减少ITGαv和ITGβ1表达,从而激活p38信号途径,通过增加caspase3和caspase9的表达来促进口腔鳞癌细胞凋亡进程。