[背景]顺铂在治疗头颈部恶性肿瘤中发挥着非常重要的作用。与此同时,也对人体产生不同水平的毒副作用,其中不可逆性的感音神经性听力损失是耳鼻咽喉-头颈外科临床常见并发症之一。哺乳动物耳蜗毛细胞极其脆弱,易受药源性、病原性以及噪声暴露等诸多因素损伤。并且在成年哺乳动物及人类内耳中,仅仅极少数前庭毛细胞在各种因素损伤后可自发再生,而内耳毛细胞损伤后无法自发再生。现关于顺铂耳毒性机制、毛细胞损伤后缺乏再生能力的机制尚未完全清楚,然而在斑马鱼侧线神经丘毛细胞损伤后,毛细胞可自发再生,研究其再生机制很大程度上可以为哺乳动物毛细胞再生提供潜在的靶点以及指明再生机制的研究方向。本课题组前期研究发现斑马鱼幼鱼侧线神经丘周围支持细胞在顺铂损伤后增殖活跃,其中新生的毛细胞来源主要为支持细胞转分化为毛细胞。Shh信号通路在斑马鱼幼鱼侧线神经丘毛细胞的再生过程中被激活,同时参与了侧线毛细胞的再生过程,在此过程中起正向调控的作用。研究报道Wnt/β-catenin信号通路不仅在斑马鱼后侧线细胞迁移起到重要作用,而且参与哺乳动物内耳早期的听基板及听泡的分化。在小鼠内耳发育过程中,Shh通路与Wnt/β-catenin通路相互拮抗,在小鼠内耳D-V轴的形成中Shh通路与Wnt/β-catenin通路起着决定性的作用。遂我们决定建立斑马鱼顺铂耳毒性模型以研究斑马鱼幼鱼侧线毛细胞在顺铂损伤后的增殖情况,并进一步研究在顺铂损伤斑马鱼幼鱼侧线神经丘毛细胞后,在毛细胞再生过程中Shh与Wnt/β-catenin信号通路的关键基因的表达情况及可能存在的联系。[目的]探讨顺铂损伤斑马鱼幼鱼侧线毛细胞后再生过程中,Shh和Wnt信号通路的作用、两信号通路主要基因的表达以及上下游的关系。[方法](1)采用顺铂溶液孵育受精后5天(5dpf)的斑马鱼幼鱼,撤药后采用FM1-43FX、BrdU、DAPI免疫荧光标记再生期间侧线神经丘的增殖细胞、毛细胞和细胞核。(2)采用FM1-43FX、BrdU、DAPI观察空白组、顺铂处理组以及顺铂与药物/溶剂共处理组,观察斑马鱼侧线神经丘再生过程增殖细胞、毛细胞和细胞核的表达情况。(3)采用斑马鱼胚胎整体原位杂交技术检测斑马鱼侧线神经丘毛细胞对照组及实验组Shh和Wnt信号通路相关基因表达情况。[结果](1)顺铂损伤斑马鱼侧线神经丘毛细胞后毛细胞可自发再生,且在一定时间内毛细胞及增殖细胞随时间增加而增加。(2)顺铂和Shh信号通路抑制剂(GANT61)共同处理后,斑马鱼侧线神经丘毛细胞及增殖数目明显少于对照组,而顺铂和Shh信号通路激动剂(SAG)共同处理后,斑马鱼侧线神经丘毛细胞及增殖细胞多于对照组。(3)顺铂和Wnt信号通路激动剂共同处理后,斑马鱼侧线神经丘毛细胞及增殖数目明显多于对照组。(4)Gli1、Dkk2、Sfrp1、β-catenin在斑马鱼毛细胞发育再生过程当中均有表达。且Gli1、Dkk2、β-catenin表达在斑马鱼侧线神经丘中央区域,Sfrp1表达于神经丘外周支持细胞。(5)顺铂与GANT61共同处理组与顺铂组比较,Gli1表达量减少,Dkk2表达较前增加,β-catenin无明显变化。顺铂与SAG共同处理组与顺铂组比较,结果发现Gli1表达量增加,Dkk2有所下降,β-catenin无明显变化。顺铂和AZ共同处理组Gli、β-catenin表达增高,Dkk2表达下降。Sfrp1在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中表达于神经丘外周的支持细胞,表达量未见增减,仅在Wnt信号通路激活时表达于中央区域。[结论](1)50uM顺铂建立的斑马鱼侧线毛细胞再生模型具备可行性。(2)在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中由多通路调控,其中Shh信号通路与Wnt信号通路在毛细胞再生过程中被激活,同时参与毛细胞再生过程,并且在此过程中起到正向调控作用。(3)Sfrp1在斑马鱼侧线神经丘最外周支持细胞中表达,是最外周支持细胞特异性的表达基因,在再生过程中Sfrp1少量表达于中央毛细胞区,即神经丘最外周支持细胞在毛细胞再生过程中作用微弱,最外周支持细胞并不是毛细胞再生细胞的主要来源。(4)Wnt信号可能作为Shh信号通路的上游信号通路共同调控顺铂损伤后斑马鱼侧线神经丘毛细胞的再生过程。